针对宠物皮肤致病菌抗菌肽的筛选及体外活性检测

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宠物犬、 猫混合皮肤病临床发病率较高， 临床上治疗难度较大， 而且极易复发， 抗生素治疗易产生耐药性。 抗菌肽相对于抗生素， 它具有高效的、 广谱的抗细菌活真菌、 病毒、 原虫等一系列活性， 更加具有无残留、 效价高、 无毒害作用、不易产生耐药性等优点。 并且肽合成简便、 价格低、 热稳定性好、 抗菌机理独特，因此近年来受到越来越多的关注， 为解决当今细菌性疾病之危害带来了希望。通过抑菌圈、 最小抑菌浓度、 最小杀菌浓度及杀菌曲线评价抗菌肽的抗菌活性， 从而筛选出针对宠物皮肤致病菌具有高抗菌、 抗寄生虫活性， 能够快速杀死菌株作用的活性肽， 为研究理化性质与筛选临床有效抗菌药物提供依据。1.1 材料金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， S.aureus ATCC29213、 USA300） ；大肠埃希氏菌（Escherichia coli， E. coli ATCC25922、 E. coli BL21） ； 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC27853） ； 白色念珠菌（Canidia albicans， C.albicans ATCC10231） 。1.1.2 多肽人工合成的生物活性肽： 生物固相合成， P1、P2、 KL-7、 RR-9、 RI-12、 JH-18、 C-P2-5、 SI-15、 KH-11、 C-RR-9， 纯度为 95%以上。1.1.3 主要试剂与材料牛肉膏、 胰蛋白胨（OXOID） 、 酵母蛋白提取物（OXOID） 、 氨苄青霉素、KCl、 琼脂粉、 Na 2 HPO 4 ·12H 2 O、 KH 2 PO 4 、 氯化钠（分析纯， 北京化工） 、 96孔平底细胞培养板、 离心管、 试管、 烧杯、 锥形瓶、 玻璃棒、 玻璃培养皿、 滤纸、涂布棒、 0.22 μm 微孔滤膜 。1.1.4 主要试剂的配置1.2 方法1.2.1 纸片扩散法药敏实验金黄色葡萄球菌与大肠杆菌做为测试菌， 并采用抑菌圈测定法检测各合成肽的抑菌活性， 以抑菌圈为指标， 测量抑菌圈大小。（1） 药敏片的制备用 6 mm 打孔器制备滤纸片， 高压蒸汽灭菌或紫外照射灭菌后备用。 分别取合成多肽各 0.01 g 分别溶于1 mL无菌蒸馏水中。滤纸片分别在50 μL多肽溶液、PBS 溶液、 无菌蒸馏水中浸泡 2 小时后， 晾干， 置于 4 ℃ 冰箱备用。（2） 菌悬液的制备本试验检测多肽对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌的药敏活性。 将活化的受试菌株接种于 LB 液体培养基中， 37 ℃气浴恒温振荡器中振荡培养 12 小时。 将测试菌液 LB 液体培养基稀释， 浓度至 1×10 6 cfu/mL， 备用。（3） 涂板培养对制备好的 LB 固体无菌培养基分别进行编号， 分别取 100 μL 各受试菌悬液， 均匀涂布于固体 LB 平皿上， 自然晾干 5 min 并标记。 将各多肽、 AMP、 无菌蒸馏水药敏片分别放置于涂布好的细菌平板表面， 倒置培养过夜培养于 37 ℃生化恒温培养箱中， 通过抑菌圈大小判定各药物对试验菌株是否具有抗性， 筛选出有抗菌活性的多肽， 进一步进行活性检测。上海喆图科学仪器有限公司慧图图° 三 用 途概述 型号 ZYC-100B ZYC-100BR ZYC-111B ZYC-111BR ZYC-263B ZYC-263BR ZGC-9251R ZGC-7446R 电源电压 AC220V 50Hz AC220V 50Hz AC220V 50Hz AC220V 50Hz 振荡频率 启动~300rpm 启动~300rpm 启动~300rpm 启动~300rpm 振荡幅度 26mm 26mm 26mm 26mm 振荡方式 逆时针回旋(可调顺时针) 逆时针回旋(可调顺时针) 逆时针回旋(可调顺时针) 逆时针回旋(可调顺时针) 控制仪表 液晶显示 液晶显示(标配紫外杀菌灯) 液晶显示(标配紫外杀菌灯) 六级可调(0~12000Lx) 托盘尺寸 w*D(mm) 400*370 450*410 920*510 920*510 920*510 740*460 温控范围 RT+5-60℃ 4~60℃ RT+5-60℃ 4~60℃ RT+5-60℃ 4~60℃ 4~60℃ 4-60℃ 制冷功能 无 可制冷 无 可制冷 无 可制冷 可制冷 可制冷 输入功率 350W 550W 600W 700W 700W 1000W 1150W 1250W 控制精度 ±0.1℃ ±0.1℃ ±0.1℃ =±2℃(37℃) 温度波动度 ±1℃ ±1℃ ±1℃ =±0.5℃(37℃) 出厂标配 50ml*4；100ml*4250ml*3；500ml*3 500ml*28 2000ml*12 2000mr8 250mr*35500ml*24 Max可选 100ml*16250ml*12500ml91000ml*4 100ml*20250ml*16500ml*121000ml-5 250ml*361000ml*18 3000ml*85000mr*6 500ml*281000ml*182000ml*123000ml*85000mr6 250ml*70500ml*48 内胆尺寸W*D*H(mm) 440*405*270 480*450*320 970*565*280 970*565*480(加高款) 980*570*500 880*530*660 外形尺寸 W-D*H(mm) 600*580*510 780*682*560 1200*740*800 1200*740*1000 1200*810*1100 950*710*1270 托盘数量 1块 1块 1块 1块 2块 定时范围 1-9999min(可连 续 运 行 ) 1-9999m i n(可连续运行) 1-9999m in (可连续运行) 1-9999m i n(可 连 续 运 行 ) 喆图°