Multitron CHO 细胞培养

智能文字提取功能测试中

Multitron CHO 细胞培养1. 简介摇瓶的使用对动物细胞的培养越来越重要。以下各种摇瓶中培养CHO（中国仓鼠卵巢）细胞的示例表明，Multitron细胞培养摇床（INFORS HT，CH Bottmingen）非常适合种子液的生产。CHO细胞系是生物技术中常用的细胞系。为了生产用于接种的种子培养液和生产SEAP蛋白，使用了CHO-XM-111细胞株。瑞士苏黎世联邦理工学院 M.Fussengerger 教授的团队用编码重组蛋白SEAP（分泌型碱性磷酸酶）基因的表达载体转染该细胞株，并使用由四环素控制的启动子PhCMV-1。表达载体的使用使得通过启动子可选择性表达两个基因成为可能。这样就可以生产SEAP蛋白，包括非生产性的生长阶段，和基于无四环素培养基交换的增殖抑制生产阶段。2. Multitron 技术参数*  50 mm 振幅 (可选25mm)*  通气 空气和  CO2 (0 – 20% asstandard)*  蒸汽湿度套件（可选）*  不同可选托盘 (一次培养袋托盘, 粘性托盘，通用托盘等)*  其他选项 (制冷, 去污, ShakerBag等)3. 实验条件为了在生物反应器中生产种子培养液（作为后期培养的接种物）和SEAP，使用CHO-XM-111细胞系，无血清和无蛋白的HP-1培养基（Cell Culture Technologies GmbH）在250 mL、500 mL和1000mL摇瓶中进行培养。在培养基中添加2g/L Pluronic F-68（Sigma）和2.5 mg/L 四环素（Sigma）。设置温度37℃，湿度85% 和5%的CO2饱和度。所有摇瓶以恒定的122 rpm转速在Multitron（INFORS-HT, CH-Bottmingen）中培养。4. 批次补料振荡培养采用不同体积的摇瓶和相应的补料策略。a) 在250ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行：天/小时 – 步骤体积（mL）每毫升细胞浓度存活百分比0 d/0 h – 接种503.0 x 10⁵86.91 d/21 h – 补料50 (+ 30 mL)6.6 x 10⁵912 d/43 h80 (max. 32%)1.95 x 10⁶97.43 d/67 h802.25 x 10⁶98.34 d/91 h801.95 x 10⁶98.7最大比生长速率μmax为0.048 h-1，倍增时间td =14.4h。图1: Multitronb) 在500ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行：天/小时 – 步骤体积（mL）每毫升细胞浓度存活百分比0 d/0 h – 接种1007.8 x 10⁵95.51 d/24 h – 补料100 (+ 50 mL)1.88 x 10⁶98.72 d/47 h – 补料150 (+ 50 mL)2.18 x 10⁶99.13 d/67 h – 更换培养基250 (+ 50 mL)2.33 x 10⁶99.34 d/91 h300 (max. 60%)2.63 x 10⁶99.75 d/115 h3004.65 x 10⁶99.46 d/139 h3003.90 x 10⁶98.17 d/163 h3002.55 x 10⁶81.8最大比生长速率μmax为0.024 h-1，倍增时间td =28.9h。c) 在1000ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行：天/小时 – 步骤体积（mL）每毫升细胞浓度存活百分比0 d/0 h – 接种1506.6 x 10⁵98.91 d/23 h – 补料150 (+ 50 mL)9.6 x 10⁵98.92 d/45 h – 补料200 (+ 50 mL)1.95 x 10⁶993 d/66 h – 补料250 (+ 50 mL)1.10 x 10⁶99.34 d/93 h3002.18 x 10⁶99.45 d/117 h –   15-fold dilution400 (max. 40%)2.25 x 10⁶98.58 d/189 h4001.40 x 10⁶66.9最大比生长速率μmax为0.044 h-1，倍增时间td =15.65h。d) 蒸汽加湿为了检测每日液体损失，使用125 mL摇瓶，工作体积为15 mL、20 mL和25 mL，在温度为37°C，湿度为85% rH的培养前后测定总体积。5. 分析a)  参数分析每天使用细胞计数器yc100（Chemotec）测定活细胞浓度。使用Bioprofile Analyzer 100 Plus（Nova Biomedical）完成生长和生产基质的分析。b)  公式对于最大生长速率μmax和倍增时间td的计算，使用以下公式。6. 结果分析为了优化CHO种子液培养，在Multitron细胞培养摇床中设置了三个不同体积的摇瓶（250ml、500ml和1000ml）。在培养CHO-XM-111细胞的同时，每天取样检测，从而可以最佳地比较细胞浓度、底物消耗和缓冲液。对比最大细胞浓度表明，500ml 摇瓶中的培养物每毫升可产生4.65×106个细胞。在所有培养物中，6天内可达到98%以上的存活率。通过优化补料策略，种子培养可在2天后进行，最多5天（图2）。图2：对比细胞浓度和活力葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量，尤其在500mL摇瓶中，表明底物在第五天之前是足够的，因此补料可防止底物限制（图3）。图3：对比葡萄糖和谷氨酰胺已知同时形成铵，乳酸和谷氨酸可降低细胞生长速率。在所有培养物中，在培养的第五天也观察到亚临界浓度的铵。此外，通气和连续供应5％的CO₂可以为培养系统提供最佳缓冲，因此也可以提供合适的pH条件（图4）。   图4:比较铵的含量，谷氨酸盐，乳酸和pH直接蒸汽加湿对培养基损失有重要影响，同时也会改变渗透压。特别是在小工作体积下，一天的最大蒸发量小于0.4%。摇瓶的工作体积对氧交换有很大影响，不应超过摇瓶最适工作体积。7. 总结培养2-5天后，细胞总数达到1.8 x 10⁸和1.4 x 10⁹之间。它可用作2.5L生物反应器的接种物，活细胞浓度约为每毫升5×10⁵。接种细胞密度和细胞活力越高，培养过程中细胞密度越高。尽早更换培养基在较小接种量和补料策略允许的情况下，可额外补充细胞培养营养物质。另一方面，培养液被稀释，因此有毒产物减少。在85%相对湿度条件下，蒸发量小于0.5%，可实现稳定的渗透压和工艺再现性。 摇瓶培养可用于进一步的工艺步骤，例如接种生物反应器或一次性袋。MultitronCHO细胞培养 1.简介 摇瓶的使用对动物细胞的培养越来越重要。以下各种摇瓶中培养CHO（中国仓鼠卵巢）细胞的示例表明，Multitron细胞培养摇床（INFORSHT，CHBottmingen）非常适合种 子液的生产。 CHO细胞系是生物技术中常用的细胞系。为了生产用于接种的种子培养液和生产SEAP 蛋白，使用了CHO-XM-111细胞株。瑞士苏黎世联邦理工学院 M.Fussengerger教授的 团队用编码重组蛋白SEAP（分泌型碱性磷酸酶）基因的表达载体转染该细胞株，并使用由 四环素控制的启动子PhCMV-1。表达载体的使用使得通过启动子可选择性表达两个基因成 为可能。这样就可以生产SEAP蛋白，包括非生产性的生长阶段，和基于无四环素培养基交 换的增殖抑制生产阶段。 2.Multitron技术参数 * 50mm振幅 (可选25mm) *通气空气和 CO2(0 – 20%asstandard) *蒸汽湿度套件（可选） *不同可选托盘 (一次培养袋托盘，粘性托盘，通用托盘等) *其他选项 (制冷，去污，ShakerBag等) 3.实验条件 为了在生物反应器中生产种子培养液（作为后期培养的接种物）和SEAP，使用 CHO-XM-111细胞系，无血清和无蛋白的HP-1培养基（CellCultureTechnologies GmbH）在250mL、500mL和1000mL摇瓶中进行培养。在培养基中添加2g/LPluronic F-68（Sigma）和2.5mg/L四环素（Sigma）。设置温度37℃，湿度85%和5%的CO2饱和度。所有摇瓶以恒定的122rpm转速在Multitron（INFORS-HT，CH-Bottmingen）中培养。 4.批次补料振荡培养 采用不同体积的摇瓶和相应的补料策略。 a)在250ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行： 天/小时–步骤 体积（mL） 每毫升细胞浓度 存活百分比 0d/0h–接种 50 3.0x10⁵ 86.9 1d/21h–补料 50(+30mL) 6.6x10⁵ 91 2d/43h 80(max.32%) 1.95x10⁶ 97.4 3d/67h 80 2.25x10⁶ 98.3 4d/91h 80 1.95x10⁶ 98.7 最大比生长速率μmax为0.048h-1，倍增时间td=14.4h。 图1：Multitron b)在500ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行： 天/小时–步骤 体积（mL） 每毫升细胞浓度 存活百分比 0d/0h–接种 100 7.8x10⁵ 95.5 1d/24h–补料 100(+50mL) 1.88x10⁶ 98.7 2d/47h–补料 150(+50mL) 2.18x10⁶ 99.1 3d/67h–更换培养基 250(+50mL) 2.33x10⁶ 99.3 4d/91h 300(max.60%) 2.63x10⁶ 99.7 5d/115h 300 4.65x10⁶ 99.4 6d/139h 300 3.90x10⁶ 98.1 7d/163h 300 2.55x10⁶ 81.8 最大比生长速率μmax为0.024h-1，倍增时间td=28.9h。 c)在1000ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行： 天/小时–步骤 体积（mL） 每毫升细胞浓度 存活百分比 0d/0h–接种 150 6.6x10⁵ 98.9 1d/23h–补料 150(+50mL) 9.6x10⁵ 98.9 2d/45h–补料 200(+50mL) 1.95x10⁶ 99 3d/66h–补料 250(+50mL) 1.10x10⁶ 99.3 4d/93h 300 2.18x10⁶ 99.4 5d/117h– 15-folddilution 400(max.40%) 2.25x10⁶ 98.5 8d/189h 400 1.40x10⁶ 66.9 最大比生长速率μmax为0.044h-1，倍增时间td=15.65h。 d)蒸汽加湿 为了检测每日液体损失，使用125mL摇瓶，工作体积为15mL、20mL和25mL，在温度为37°C，湿度为85%rH的培养前后测定总体积。 5.分析 a) 参数分析 每天使用细胞计数器yc100（Chemotec）测定活细胞浓度。使用BioprofileAnalyzer100Plus（NovaBiomedical）完成生长和生产基质的分析。 b)公式 对于最大生长速率μmax和倍增时间td的计算，使用以下公式。 6.结果分析 为了优化CHO种子液培养，在Multitron细胞培养摇床中设置了三个不同体积的摇瓶 （250ml、500ml和1000ml）。在培养CHO-XM-111细胞的同时，每天取样检测，从而 可以最佳地比较细胞浓度、底物消耗和缓冲液。 对比最大细胞浓度表明，500ml摇瓶中的培养物每毫升可产生4.65×106个细胞。在 所有培养物中，6天内可达到98%以上的存活率。通过优化补料策略，种子培养可在2天 后进行，最多5天（图2）。 图2：对比细胞浓度和活力 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量，尤其在500mL摇瓶中，表明底物在第五天之前是 足够的，因此补料可防止底物限制（图3）。 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量，尤其在500mL摇瓶中，表明底物在第五天之前是 足够的，因此补料可防止底物限制（图3）。 图3：对比葡萄糖和谷氨酰胺 已知同时形成铵，乳酸和谷氨酸可降低细胞生长速率。在所有培养物中，在培养 的第五天也观察到亚临界浓度的铵。此外，通气和连续供应5％的CO₂可以为培养 系统提供最佳缓冲，因此也可以提供合适的pH条件（图4）。 图4：比较铵的含量，谷氨酸盐，乳酸和pH 直接蒸汽加湿对培养基损失有重要影响，同时也会改变渗透压。 特别是在小工作体积下，一天的最大蒸发量小于0.4%。 0> working volume in mL 摇瓶的工作体积对氧交换有很大影响，不应超过摇瓶最适工作体积。 7.总结 培养2-5天后，细胞总数达到1.8x10⁸和1.4x10⁹之间。它可用作2.5L生物反应器 的接种物，活细胞浓度约为每毫升5×10⁵。 接种细胞密度和细胞活力越高，培养过程中细胞密度越高。 尽早更换培养基 在较小接种量和补料策略允许的情况下，可额外补充细胞培养营养物质。另一方面，培养液 被稀释，因此有毒产物减少。 在85%相对湿度条件下，蒸发量小于0.5%，可实现稳定的渗透压和工艺再现性。 摇瓶培养可用于进一步的工艺步骤，例如接种生物反应器或一次性袋。