朝鲜白头翁中三萜皂苷检测方案(制备液相色谱)

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1628.中草药(Ch inese Traditional and HerbalDrugs 第39卷第11期2008年11月 (8H，overlap，4×-COCHCH2NO2)，4.81(8H，over-lapped，4×-COCH2CH2NO2)。氢谱与文献报道比较，鉴定化合物Ⅴ为2，3，4，6-四-氧-(3-硝基丙酰基)-α-D-葡萄吡喃糖。 化合物Ⅵ：白色针晶(丙酮)，与同属植物苏木蓝根I3]中获得的化合物 co ronarian 理化性质相似，共薄层色谱时其显色行为和Rf值均一致，故鉴定为co ronarian， 即2，6-二-氧-(3-硝基丙酰基)-α-D-葡萄吡喃糖。 化合物Ⅷ：白色针晶(丙酮)，与同属植物苏木蓝根中获得的化合物co ro llin 3理化性质相似，共薄层色谱时其显色行为和Rf值均一致，故鉴定为co ro llin，即2，3，6-三-氧-(3-硝基丙酰基)-α-D-葡萄吡喃糖。 化合物Ⅷ：白色长针状结晶(氯仿)，与同属植物苏木蓝根中获得的化合物3-硝基丙酸理化性质相似，共薄层色谱时Rf值一致，用溴酚蓝乙醇溶液显色均呈亮黄色，故鉴定为3-硝基丙酸。 化合物和X：白色颗粒状固体(甲醇)，H-NMR (CsDN) 8. 5.34(br s，H-6)，5.21(dd，J=15.0，8.5 Hz，烯氢)，5.07(d，J= 7.5 Hz，H-1')，4.58(dd，J= 12.0， 2.0 Hz，H-6'a)， 4. 43 (dd，J=12.0，5.0 Hz，H-6’b)， 3.93~ 4.33(H-3及葡萄糖上其他质子)。其溶解性、薄层色谱显色行为、Rf值和氢谱数据与同属植物苏木蓝根中获得的豆甾醇-3-氧-葡萄糖苷和胡萝卜苷混合物31均一致，故鉴定为豆甾醇-3-氧-葡萄糖苷与胡萝卜苷约1：2的混合物。 化合物XI：白色晶体(丙酮)，与同属植物苏木蓝根中获得的β谷甾醇对照品共薄层色谱，其显色行为和Rf值均一致，故鉴定为β谷甾醇。 化合物XII：白色针晶，与同属植物苏木蓝根中 获得的羽扇豆醇共薄层色谱时，其显色行为和Rf值均一致B，故鉴定为羽扇豆醇。 化合物XII：白色半透明状固体(丙酮)，与同属植物苏木蓝根中获得的白桦脂酸共薄层色谱时，其显色行为和Rf值均一致31，故鉴定为白桦脂酸。 4 讨论 花木蓝根中含有大量的3-硝基丙酮、3-硝基丙酸乙酯以及 coro llin、cibarian、co ronarian、6-氧-丙烯酰基-2，3-二-氧-(3-硝基丙酰基)-α-D-葡萄吡喃糖2，3，4，6-四-氧-(3-硝基丙酰基)-α-D-葡萄吡喃糖等3-硝基丙酰基葡萄糖类化合物，该类化合物在人或动物的胃中极易水解生成3-硝基丙酸，从而导致人和动物中毒3.4。因此，花木蓝根中含有大量3-硝基丙酸及其葡萄糖酯类化合物可能是引起毒性的主要成分。另外，对花木蓝茎和叶的化学研究表明，其地上部分虽然也含有此类化合物，但量很低，提示3-硝基丙酸以及3-硝基丙酰基葡萄糖类化合物主要集中在花木蓝的根中。 ( 参考文献： ) ( [1]方云亿，郑朝宗.国产木蓝属的系统研究[J].植物分类学 报，1989，2 7 (3)：1 6 1-177. ) ( [2] 徐国钧，徐珊.常用中药材品种整理和质量研究[M].福州：福建科学技术出版社，1994. ) ( [3] 苏艳芳，张新鑫，杨 静，等.苏木蓝化学成分的研究[J]. 中草药，2004，35(6)： 608-611. ) ( [4] Su Y F， L i C Z， Ga o Y， e t a l. 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H eterocycles， 2004， 6 3(2)：359-366. ) 循环制备HPLC分离纯化朝鲜白头翁中三萜皂苷 关颖丽.2，尹虹，刘建宇，许永男 (1.沈阳药科大学 SK Chem icals 药物研究室，辽宁沈阳110016；2.通化师范学院制药与食品科学系，吉林通化134002) 摘要：目的研究分离纯化朝鲜白头翁中三萜皂苷的新方法。方法去利用溶剂提取法、柱色谱法及循环制备 HPL C 进行分离纯化。结果 从朝鲜白头翁中分离得到4个化合物，分别鉴定为： 3-0-0L-rham nopyrano syl (1一2) [JD -glucopyrano syl (1一4)]-aL -arabinopyrano syl hederagenin 28-0-L -rham nopyrano syl (1一4)-BD-glucopy- ( 收稿日期：2008-04-16 ) ( 作者简介：关颖丽(1974-)，女，吉林通化人，讲师，硕士，主要从事生药有效成分的分离鉴定及生物活性研究。 ) ( Tel： ( 0435)3209377 Em a il： guanyingli7151@126. com ) ( *通讯作者许永男 T el： (024)23986445 场 Email ynxucn@yahoo. com . cn ) rano syl (1一6)-BD-glucopyrano side (Ⅰ)、cernuo sides A (ⅡI)、cernuo sides B (ⅢI)、oleanolic acid 28-0-L-rham nopyrano syl (14)-BD-glucopyrano syl (1→6)-BD-glucopyrano side (Ⅳ)。结论1化合物Ⅳ为首次从该属植物中分离得到，此外循环制备HPLC 可作为天然产物、合成医药研究的有效手段。 关键词：朝鲜白头翁；三萜皂苷；循环制备HPLC 中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：0253-2670(2008)11-1628-04 朝鲜白头翁 Pulsatilla cernua(Thunb.)Bercht. et Op iz 为毛莨科白头翁属植物，主要分布于我国吉林辽宁、黑龙江等地区，具有清热解毒凉血止痢的功效。主要含三萜皂苷类成分[2.3]，具有很强的生物活性。本实验利用循环制备HPLC对朝鲜白头翁化学成分进行系统地分离41，从中分离得到4个化合物，经波谱鉴定分别为： 3-0-cL-rham nopyrano syl (1→2)[BD-glucopyrano syl(1一4)]-w-L -arabinopyrano syl hederagenin 28-0-α-L -rhamnopyranosyl (1一4)-BD-glucopyrano syl(1一6)-D-glucopyrano side (Ⅰ)、朝鲜白头翁苷A(cernuoside A ， Ⅱ)、朝鲜白头翁苷B(cernuo side B，Ill)、o leano lic acid 28-0-wL -rham nopyrano syl(1一4)-BD-glucopyrano syl((1一6)-D-gluco-pyranoside (Ⅳ)。其中化合物Ⅳ为首次从该属植物中分离得到。 1仪器与材料 LC-9103 型循环制备高效液相色谱仪(日本分析工业株式会社)，UV- 3702B 型检测器，RI7型检测器，MultiChro 2000 色谱工作站，BrukerAV- 600 核磁共振仪(瑞士Bruker 公司)，W atersOuattro m icro API三重四极杆串联质谱仪(ESI源)(美国W aters 公司)。 朝鲜白头翁 P. cernua (Thunb.) Bercht. etOpiz 采自辽宁省抚顺清原地区，由沈阳药科大学孙启时教授鉴定。D-101型大孔吸附树脂(天津制胶厂)，薄层色谱用硅胶G和柱色谱用硅胶(200~ 300目)(青岛海洋化工厂)，所用试剂为分析纯或色谱纯。 2方法与结果 2.1 样品的制备：取朝鲜白头翁干燥根350 g，用50%乙醇回流提取3次，每次4h，合并滤液，浓缩，水混悬后依次用石油醚二氯甲烷、醋酸乙酯正丁醇萃取。取正丁醇萃取物经D-101大孔吸附树脂，以乙醇-水梯度洗脱，将所得的50%乙醇洗脱液经硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇-水梯度洗脱，分别取流份(100：30：4)、(100∶60：10)，利用循环制备HPLC分离。 2.2 色谱条件：色谱色为 JA IGEL ODS APL柱 (500 mm×20mm，15 um)，JA IGEL GS310柱(500mm×21.5mm)；流动相：乙乙-甲醇(3∶2)，甲醇-正己烷(5：3)；体积流量：5mLm in；柱温；室温；检测波长：210 nm； 进样量： 6mL。 2.3色谱分离：以流份(100∶60：10)样品为例，利用循环制备HPLC分离。将其溶于流动相乙腈-甲醇(3： 2)，ODS 色谱柱分离，分别为UV检测器及RI检测器检测峰信号(图1)。样品首次通过色谱柱时检测到4个峰信号，保留时间为50~ 85m in。经条件摸索，在保留时间为 50 m in 时启动仪器的循环系统，不收集组分，这样可以把前面的杂质峰除去，只保留样品峰，从而单独使样品在整个系统中循环一次，相当于样品两次通过色谱柱，进行两次分离。在保留时间为100 m in 时，根据峰信号开始收集各组分。 t/min 图1 样品的循环制备HPLC谱图 Fig.1 Recycling preparative HPLC of sam ple 以所收集的组分 signal 2'为例，再次利用循环制备HPLC分离。将其浓缩后溶于流动相乙腈-甲醇(3∶2)，GS色谱柱分离(图2)。UV 检测器只检测出1个主峰，而通用型RⅠ检测器出现明显的2个峰。经条件摸索，在保留时间为20m in时启动仪器的循环系统，设置样品在整个系统中循环两次后，样品进行3次分离。再依据RI检测器的峰信号收集主峰，则signal 2'即得化合物Ⅱ。同样方法从signal 1'和sig-nal 3'分别得到化合物Ⅰ和I。 同样利用此法从流份(100：30：4)中分离得到化合物Ⅳ。 2.4 结构鉴定 化合物Ⅰ：白色粉末(甲醇)， L iebemm ann-Burchard反应和Molish 反应均为阳性。ESI-M S 图Signal2'的循环制备HPLC 谱图 Fig.2 Recycling preparative HPLC of Signal2' m /z： 1382.1[M-H]，1405.9[M+Na]，与分子式C6sH106031一致。其'H-NMR及"C-NMR数据(表1)与文献对照[5，6]一致，据此推断化合物Ⅰ为3-0-α- L -rham nopyranosyl (1→2) [BD -glucopyrano syl(1一4)]-L -arabinopyrano syl hederagenin 28-0 -o-L -rham nopyrano syl (1一4)-BD-glucopyrano syl(1一6)-D-glucopyrano side。 化合物Ⅱ：白色粉末(甲醇)，L iebem ann-Bur-chard 反应和M olish 反应均为阳性。 ESIMSm/z：1527.8[M-H]，1552.5[M+Na]，与分子式C7H116O35一致。其'H-NMR及"CNMR数据(表1)与文献对照71一致，据此推断化合物Ⅱ为 cernuo-sides A. 化合物Ⅲ：白色粉末(甲醇)，L iebem ann-Bur-chard 反应和M olish 反应均为阳性。]ESIM Sm/z：1544.1[M-H]，1569.0[M+Na]t，与分子式CnH116O36一致。其'HNMR及'CNMR数据(表 表1 化合物I~Ⅳ的碳谱数据(600M Hz， CsDsN， Table 1 C-NMRData of com pounds I- Ⅳ (600MHz， CsDsN，8 c位 I I II c位 I 1 39.1 39.0 39.0 39.0 glc 1 106.8 105.1 105.1 2 26.1 26.8 26.4 28.1 2 75.5 74.7 75.1 3 81.0 88.7 81.8 78.8 3 78.9 78.6 78.5 4 43.5 39.7 43.6 39.4 4 71.2 71.6 71.5 5 48.2 56.0 47.6 55.8 5 78.8 78.3 78.2 6 18.1 18.6 18.5 18.9 6 62.5 62.5 62.4 7 32.6 33.1 32.7 33.1 rha 1 101.7 101.6 101.6 8 39.9 40.0 39.9 39.9 2 72.5 71.8 71.9 9 47.8 48.2 48.2 48.1 3 72.6 83.4 83.5 10 36.9 37.1 36.9 37.4 4 74.2 72.8 73.1 11 23.9 23.8 23.9 23.7 5 69.7 69.8 69.9 12 123.0 122.9 122.9 122.9 6 18.6 18.6 18.6 13 144.1 144.2 144.1 144.8 gle"" 1 106.8 106.8 14 42.2 42.2 42.1 42.2 2 75.5 75.5 15 28.3 28.3 28.3 28.3 3 76.6 76.8 16 23.4 23.4 23.4 23.4 4 69.5 69.7 17 47.0 47.1 47.0 47.4 5 76.8 76.8 18 41.7 41.7 41.6 41.7 6 61.9 61.8 19 46.2 46.3 46.2 46.3 C-28 20 30.8 30.9 30.8 30.8 glc' 1 95.7 95.7 95.7 95.7 21 34.0 34.1 34.0 34.0 2 73.9 74.1 73.9 73.9 22 32.8 32.6 32.5 32.5 3 78.6 78.8 78.8 78.8 23 63.9 28.4 64.0 28.8 4 70.9 70.8 70.8 70.9 24 14.1 17.3 14.3 16.6 5 78.1 78.1 78.1 78.1 25 16.2 15.8 16.2 15.7 6 69.2 69.2 69.2 69.2 26 17.6 17.6 17.5 17.6 glc 1 104.9 104.9 104.9 104.9 27 26.3 26.2 26.1 26.1 2 75.2 74.9 74.8 75.4 28 176.6 176.7 1)与文献对照I7一致，据此推断化合物ⅢI为 cernuo-sides B. 化合物Ⅳ：白色粉末(甲醇)，L iebemannBur-chard 反应和M olish 反应均为阳性。 ESIM Sm/z：925.8[M-H]，949.7[M+Na]*，与分子式C48H78017一致。 其'HNMR (600MHz， CsDsN ) 80.89，0.90，0.94， 1.03，1.12，1.22， 1.23(7×3H，s，-CH3)，5.43(1H，brs，H-12)，1.69(3H，d，J= 6.2Hz， CH3 of rha)， 6.23(1H， d，J= 8.0 Hz， glc'-1-H)，4.98(1H， d，J= 7.8 Hz， glc"-1-H)， 5.83 (1H，brs， rha'-1-H)。C-NMR(600 M Hz， C5DsN)数据(表1)与文献对照[8]一致，据此推断化合物Ⅳ为oleanolic acid 28-0-aL-rham nopyrano syl (1一4)-BD-glucopyrano syl(1一6)-βD-glucopyrano side，为首次从该属植物中分离得到。 3讨论 从以上实验结果可以看出，当样品第一次通过色谱柱时，各组分之间的峰有所重叠，4个组分化学结构极为相似，各峰之间未达到基线分离，分离度较低。(而采用循环系统，通过设置程序，可以使样品进行多次循环，反复经过色谱柱进行分离，最终的分离 结果是每次分离效果的累加。具有分辨率高、检验方便收集产物准确、质量分数高等优点。这样在一般的高效液相色谱上很难或不能分离的样品可以利用循环功能，达到满意的分离效果，因此循环制备HPLC 可成为天然产物、合成医药研究的有效手段。 致谢：沈阳药科大学孙启时教授在本课题的药材鉴定中给予的帮助。 ( 参考文献： ) ( [1] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上册.上海：上海科学技术出版社，1977. ) ( [2] Bang S C， K m Y， Lee J H， e t a l . 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