液液萃取法结合高效液相色谱－串联质谱测定蜂王浆中的氯霉素残留量

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食品科学※分析检测2008， Vol. 29， No. 05341 液液萃取法结合高效液相色谱一串联质谱测定蜂王浆中的氯霉素残留量 周萍1，胡福良2*，龚珊1，徐权华1，徐 初，唐惠洋1 (1.浙江蜂之语蜂业集团有限公司，浙江桐庐 3115002.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310029) 摘 要：本研究介绍了一种简便实用的液液萃取样品前处理技术，无需经过固相萃取柱即可富集纯化样品，在质谱仪上可达到与固相萃取相同的检测效果，能很好地检测氯霉素残留量，不产生干扰，使样品前处理的成本大幅度降低。 关键词：液液萃取法；高效液相色谱-串联质谱；蜂王浆；氯霉素残留 Determination of Chloramphenicol in Royal Jelly by HPLC-MS-MS through Liquid-liquid Extraction ZHOU Ping， HU Fu-liang2*， GONG Shanl， XU Quan-hual， XU Chul， TANG Hui-yang (1. Zhejiang Beewords Apiculture Group Co. Ltd.， Tonglu 311500， China2. College of Animal Science， Zhejiang University， Hangzhou 310029， China) Abstracts： Inthis study， a convenient liquid-liquidextraction method for sample preparation was introduced， which canenrich andpurify chloramphenicol in royal jelly toasimilar level compared to sample treated by solidphase extraction (SPE).This method showed no interference on the determination of chloramphenicol， and it greatly reduced the cost of samplepreparation. Key words： liquid-liquid extraction HPLC-MS-MS royal jelly chloramphenicol 中图分类号：TS207.53 文献标识码A 文章编号：1002-6630(2008)05-0341-03 氯霉素残留是近年来严重影响中国蜂王浆等动物源产品出口的重要原因之一。世界各国对氯霉素残留量限制一直非常严格，特别是日本肯定列表制度的实施，对蜂王浆及蜂王浆冻干粉的氯霉素残留限量由原来的50×10°调整为5×10，使得蜂王浆中氯霉素残留量的检测方法的研究越来越重要[1]。蜂王浆中氯霉素残留量检测方法的检出限问题已经在国际贸易中成为新的技术性壁垒，加快氯霉素检测方法的研究，具有重要意义。 食品中的氯霉素残留有多种检测方法，如HPLC-UV 法[2]、GC法[3]、LC-MS-MS法[4]、ELISA法[5]等，各种方法的检出限和鉴定的简捷方便程度逐渐成为关注的焦点。由于 HPLC-UV 法检出限有限， GC 和ELISA法存在假阳性的现象。LC-MS-MS 法以其良好的检测限和较高的精确性等特点而广泛地被检验检疫部门采用。在LC-MS-MS 法测定王浆中的氯霉素残留量时，一般采用固相萃取柱的预处理方法[4，6]，这大大提高了检测成本。 本研究提供一种简便实用的液液萃取样品前处理技术，无需经过固相萃取柱即可富集纯化样品，在质谱仪上可达到和固相萃取相同的检测效果，能很好地检测氯霉素残留量，不产生干扰，使样品前处理的成本大幅度降低。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 蜂王浆产于浙江省桐庐县的油菜花期，由浙江蜂之语蜂业集团公司实验蜂场提供。 氯霉素标准品(纯度≥99.9%) Sigma-aldrich公司；D5-氯霉素标准品(100mg/L) 德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯为农残级；；高氯酸、氢氧化钠、甲醇、氯化钠均为分析纯；乙腈、乙酸铵均为色谱纯；双重蒸馏水。 1.2 仪器 API3200串联四极杆质谱仪；安捷伦1200高效液相 ( 收稿日期：2007-06-14 ) ( 作者简介：周萍(1969-)， 男 ，助理工程师，主要从 事 食品分析测试研究。E-mail： tdbjhn@126. com ) ( *通讯作者 ： 胡福良(1964-) ， 男 ， 教授 ， 主要从事蜂产品及功能性 食 品研究。E-mail； flhu@zju. edu. cn ) 色谱仪(配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、Analyst数据处理软件)； Sartorius BS224S万分之一分析天平； PHS-3C雷磁精密pH计； RJ-TDL-40B低速台式大容量离心机 无锡市瑞江分析仪器有限公司；Organomation N-EVAP 111氮吹仪。 1.3 方法 1.3.1 样品前处理 称取蜂王浆5g(称定至4.95~5.05g之间)，蜂王浆冻干粉2g(称定至1.98~2.02g之间)至50ml离心瓶，加入50×109的D5-氯霉素标准品(CAP-d5)溶液200p1，加15ml蒸馏水，连续振摇使之均匀，干粉需反复振振2~3次，以确保干粉完全分散，在混合器上振荡30s，取下，内标混合均匀后加入8ml8%HC104，混合器上振荡30s，摇匀后2500r/min离心10min，吸取上清液，用定量滤纸过滤，向残渣加入8%HC10448ml重复提取一次，合并两次的滤液，用40% Na0H/8% HC104调节样液pH8.0±0.1，分别用15、10ml CHsC0OC2Hs 萃取CAP， 离心后收集两次上层清液，氮吹仪N2吹干后，残留物用100u1甲醇溶解，再加1mol/L氯化钠溶液2ml， 混合器上混合1min，加4ml×2 CH3COOC2Hs提取CAP，离心1min，吸取上层清液，氮吹仪N2吹干，用3：7乙腈水溶液2ml 超声溶解、混合均匀，过0.45um滤膜，上LC-MS-MS分析。稀释倍数：王浆0.4，干粉1.0. 1.3.2 LC-MS-MS分析条件 色谱柱： ZORBAX Eclipse XDB-Ci8( 4.6×150mm，5um)；流动相：A为乙腈，B为5mmol/L乙酸铵(含10%乙腈)，采用梯度洗脱；柱温：30℃；流速： 0.8ml/min；进样量：10ul；离子化法：ESI Negative；离子喷雾电压(IS)：-4100V；离子源雾化温度(TEM)：650℃；去集簇电压(额定电压)(DP)：：-32V；激发碰撞电压(CE)：-24V(定量)，-18V(定性)；；设定质量数：m/z 321.0→152.0(定量用)，321→193.9，321→256.9(确认用)内标物质326.0→157.1。见表1。 表1 分析条件 Table 1 Analysis condition 日间(min) 6 0.1 2.0 2.1 5.5 5.51 10.0 B (%) 78 78 22 5 5 78 78 流速(ul/min) 1000 800 800 800 800 800 800 1.3.3 标准品配制方法 用水-乙腈(7：3)溶液配制成100×10°CAP和10×10°CAP标准溶液(以1×10-6 100pl母液+900ul水-乙腈(7：3)溶液混合，再倍比稀释而成)；用100%的乙腈配制50×10°的CAP-d5标准溶液(以1×106100ul母液+900ul乙腈溶液混合，再倍比稀释而成)；根据表2进行混合。溶液配好后经0.45以m的滤膜过滤。 2 结果与分析 21 LC-MS-MS 测定的蜂王浆总离子流图和提取液离子流图 图1 LC-MS-MS测定的蜂王浆阳性样品总离子流图 Fig.1 Total ionic chromatogram determined by LC-MS-MS inpositive samples of royal jelly Table 2 Confect ratio 标准准液 1×10°℃AP(含5×10-°CAP-d5) 5×10°CAP(含5×10CAP-d5) 10×10CAP(含5×10°CAP-d5) 20×10CAP(含5×10-°CAP-d5) CAP (ul) 100(10×10-9) 500(10×109) 100(100×109) 200(100×109) CAP-d5 50×109(u1) 100 100 100 100 水-乙腈(7：3)(1) 800 400 800 700 总溶液量(ul) 1000 1000 1000 1000 图2 LC-MS-MS 测定的蜂王浆阳性样品提取液离子流图 Fig. 2 Distilled ionic chromatogram determined by LC-MS-MS inpositive samples of royal jelly 2.2 样品前处理条件 梅素荣等采用乙酸乙酯萃取、C18小柱净化[4]，谢文等采用偏磷酸法沉淀蛋白质，用Oasis HLB柱净化样品[7]。我们在采用上述方法进行分析测定时发现存在一定程度的干扰，特别是C18小柱纯化方法，干干扰明显。 本法采用高氯酸沉淀蜂王浆中蛋白质，用氢氧化钠调节提取液的pH值至8.0±0.1时，再用乙酸乙酯萃取氯霉素，最后用甲醇-氯化钠溶液进一步萃取。方法简单、快捷，在样品测定的总离子流图上未见有干扰峰存在，纯化结果较为彻底。而在用三氯乙酸、偏磷酸、乙酸乙酯沉淀蛋白时结果均不理想，会产生较大的干扰。用本法中的样品净化方法测定蜂王浆中氯霉素残留的总离子流图和提取液离子流图见图1、2。 23 色谱条件 该方法在不影响定量检测限0.1ug/kg的前提下，进样量确定为10ul，以尽量减少对仪器的污染。流速确定为800ul/min， 以保证通过喷口时形成恒定均匀的带电的雾滴流。采用梯度洗脱程序改善了峰形，提高了方法的灵敏度。在流动相中增加10%的乙腈，解决了乙酸铵水溶液易受微生物污染造成仪器污染的问题，而且分析时间缩短。 24 质谱条件 在m/z300~400扫描范围内以负离子模式进行Q1 MS(Q1)全扫描，确定分子离子峰为m/z 321.0；以321.0作为母离子，进行子离子扫描，调节DP、EXP、CE 参数，使母、子离子都具有一定的强度，一般母离子的强度占1/3~1/4为最佳，从质谱图中选择四个信号较强的子离子m/z=321.0/152.0、m/z=321.0/175.9、m/z=321.0/193.9、m/z=321.0/256.9，以m/z=321.0/175.9、m/z=321.0/193.9、m/z=321.0/256.9作为定性离子，离子丰度最强的m/z=321.0/152.0为定量离子，采用针泵流动注射标准溶液，手动运行RAMP进行优化参数，用同样的方法确定内标d5-氯霉素标准溶液的母离子峰m/z=326.0和子离子峰m/z=321.0/157.1作为定量离子。 25 线性范围、检出限、回收率和精密度 氯霉素的浓度在0.5~20ug/kg之间时呈现良好的线性关系，线性方程为： y-0.358x+0.018，相关系数R2=0.9999。 以信噪比 S/N=3对应浓度确定检出限为0. 1ug/kg。 在蜂王浆样品中分别添加0.3、2.0、5.0ug/kg的氯霉素，按本方法进行样品的处理与测定的结果见表3，氯霉素加标回收率在98.0%~101.3%，相对标准偏差为0.81%~2.08%，符合国际贸易对氯霉素残留限量检测的要求。 表3 阴性蜂王浆样品中添加不同浓度氯霉素的回收率(n=3) Table 3 Recovery of adding different concentrationschloramphenicols in negative samples of royal jelly (n=3) 加入浓度 测得浓度 回收 平均回 相对标准偏 (g/kg) (Ig/kg) 率(%) 收率(%) 差(%) 0.3 0.30 99.0 0.3 0.29 96.7 98.0 1.18 0.30 98.3 1.98 99.0 2.04 102.0 99.7 2.08 2.0 1.96 98.0 5.07 101.4 5.10 102.0 101.3 0.81 5.02 100.4 3 讨 论 采用高氯酸沉淀蜂王浆中蛋白质、氢氧化钠调节提取液的pH 值至8.0±0.1时，再用乙酸乙酯萃取氯霉素，最后用甲醇-氯化钠溶液进一步萃取的样品预处理方法检测蜂王浆中氯霉素残留量，具有前处理简单、检出限低、精确度高、干扰小、检测成本更低的特点。采用梯度洗脱、流动相中添加一定量的乙腈，，可以改善峰形，提高检测方法的精确度。 本实验对近2000批蜂王浆样品进行了测定，结果氯霉素残留小于0.3×109的占58.6%，氯霉素残留在0.3×109~1.0×109的占21.4%，氯霉素残留在1.1×109~5.0×10°的占9.9%，大于5.0×109的占10.0%。最高的达到了1910ug/kg。从检测结果看，中国蜂王浆的氯霉素残留情况还是不容乐观，解决蜂王浆的安全性问题任重而道远。 ( 参考文献： ) ( 1 周萍， 章 征天，钱志明，等.出口蜂王浆的药物残留现状及其对策[J].蜜蜂杂志，2007，27(4)：3-5. ) ( 2 欧阳立群，吴富忠.水产品中氯霉素残留量的高效液相色谱测定方法[J]. 中 国卫生检验杂志，2005， 15( 2 )：178. ) ( 3 王建华，陈世山.同时测定鱼肉中氯霉素和甲砜霉素残留量的毛细管气相色谱法[J].分析测试学报，2001 ， 20(3)：89-91. ) ( 4 梅素容， 王 鹏，朱宽正，等.用液相色谱-串联质谱法测定蜂王浆中氯霉素残留量[.华中科技大学学报自然科学版，2006，34(2)：115 - 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