上海通微多用加压梯度毛细管电色谱分离哒嗪酮衍生物

智能文字提取功能测试中

用加压梯度毛细管电色谱分离哒嗪酮衍生物 江正瑾，高茹玉，阎超等 摘要： -种加压、梯度毛细管电色谱(pCEC)仪已经设计生产出来。这种多用仪器能够使用三种分离模式，加压梯度毛细管电色谱(pCEC)、微径高效液相色谱(uHPLC)和毛细管电泳(CE)。在 pCEC 模式中结合了电动力和压力推动样品经过毛细管填充柱，不需要改变流动相的组成就能进行好的选择性调节。这项技术也易于进行梯度洗脱，更利于对复杂的混合物进行分离。这项研究通过对一有机酸和中性哒嗪酮衍生物混合物的分离同 uHPLC 相比较及评估。实验用的 pCEC 使用一根熔融石英毛细管柱并填充 3um 粒径的十八烷基键合相硅胶(ODS)。在适宜的条件下十种哒嗪酮衍生物都实现了基线分离。比较用 uHPLC 方法的分离结果， pCEC 对于分离所有的中性物质和带电物质比 uHPLC 的分离更强。对于压力、泵的流速以及电压对分离的影响也做了研究。 关键词：毛毛管电色谱(CEC)；加压毛细管电色谱(pCEC)；微径高效液相色谱(uHPLC)；哒嗪酮 简介： 毛细管电色谱(CEC)是一种结合了高选择性的高效液相色谱(HPLC)和高柱效的毛细管电泳(CE)同时能分析中性物质和带电物质的微分离技术。CEC 分离中性物质的机理是基于样品组分在流动相和固定相间的不同分配。对于带电物质，不同的电泳淌度是形成样品分离的机理。由于 CEC 中流动相受电渗流(EOF)的驱使且与填料粒径无关除非双电层发生重叠，小的粒径能够实现更高柱效的分离。另外，在 CEC 中 EOF 产生柱塞状流型更提高了它的柱效。尽管 CEC 有了一定的发展并获得了声望，但是还存在着一些困难以及与柱子和仪器相关的问题。要充分发挥 CEC 的潜能，就需要发展一套类似于 HPLC 的毛细管梯度洗脱技术，以成功实现分离一个多组分的复杂样品。 到目前为止商业化的毛细管电泳(CE)仪已经被用来进行 CEC 的试验。然而，商业化的 CE在它们目前的设计上因为柱子干结以及产生气泡的问题同 CEC 运作不是很兼容。CEC 中压力由一个或多个 HPLC 泵提供， 压力能克服柱子干结与产生气泡问题。这项技术称之为加压毛细管电色谱(pCEC)。 HPLC 的高液压同 CE 的高电压结合发展出的 pCEC 在多方面优于单纯的 CEC。可以参阅几篇已发表的关于 pCEC的文献。尽管CE 可以用作分步梯度 CEC，一个众所周知的缺点就是不能进行连续溶剂梯度洗脱 CEC。有几篇发表的文章报道了用自制的梯度 CEC 系统获得了令人鼓舞的结果。 本文我们报道了发展加压 CEC 系统包括一个溶剂梯度传输模块，，一个高压电源装置，17一个可变波长UV/Vis 检测器， 一个微量手动进样模块和一个数据处理系统。这个仪器能够用作pCEC、uHPLC 和 CE， 它也能做溶剂梯度洗脱。本实验用专业的 pCEC 系统通过对一有机酸和中性哒嗪酮衍生物混合物的分离同 uHPLC 相比较及评估，对于压力、泵的流速以及电压对分离的影响也进行了研究。 试验 仪器： TriSepTM2000GV CEC系统(通微分析仪器公司 Pleasanton， CA， USA) 由一个溶剂梯 度传输模块，一个高电压装置，一个可变波长紫外可见光检测器，T9一个微量手动进样模块(20pL 进样阀)和一个数据处理模块。死体积在接头处约为500nL。 材料：两根毛细管柱由 Unimicro Technologies Inc.(Pleasanton， CA， USA)提供，长度、内径分别为210mm×75um 和150mm×150pm，填充以粒径 3um 的 ODS为固定相。实验一系列我们有机合成实验室合成的哒嗪酮衍生物。红外光谱和元素分析确认了这些结构，展示在图二。茴香酸、p-氯苯甲酸、苯甲酸和苯丙烯酸以及四硼酸钠从天津第三化工厂购得；磷酸二氢钾从沈阳第一化工厂购得，以上试剂都是分析纯。乙腈和甲醇从河北新科化学品公司购得，为色谱纯。使用去离子水。 样品：样品化合物首先用甲醇溶解并定容在10ml 容量瓶中，浓度约 1mg/mL。然后再将该溶液用流动相在 10mL 的容量瓶中稀释成约 0.1mg/mL。所有这些溶液都用 0.22um 的微孔滤膜过滤。流动相 A 为 0.005M的磷酸和 0.0025M 的硼酸水溶液(pH=6.0)，流动相B为乙腈。流动相在使用前用超声波脱气至少15分钟。分离样品使用线性梯度洗脱(B的比例在10分钟内从15%-80%)。电压加在柱子的两端。在分离过程中柱子的入口始终保持有压力。双泵的流速范围从 10pL/min 到 50pL/min。紫外可见光检测器的波长设定为254nm。进样量为20nL。 结果和讨论 用p-CEC 分离十种哒嗪酮衍生物： 哒嗪酮衍生物广泛地使用在杀虫剂和医药领域，因为它们的高生物活性而引起专家们极大的兴趣。它们是高效和低毒性以及广谱的杀虫剂。因为它们类似的结构对于分离这些化合物具有相当大的挑战性。如下图所示，用加压梯度 CEC 在14分钟里就得到了对10种哒嗪酮衍生物的基线分离。 p-CEC 和p-HPLC 的比较：为了比较 p-CEC 和 u-HPLC的分离效果，我们在10种哒嗪酮衍生物中加入了四种酸(A1茴香酸、A2p-氯苯甲酸、A3苯甲酸和A4苯丙烯酸)。所有的 p-CEC和 u-HPLC 的实验都在同样的 TreSep M2000GV CEC 系统和同样的柱子上进行。下图显示了p-CEC 和 u-HPLC 的图谱比较。很明显，哒嗪酮衍生物在 p-CEC 和 u-HPLC 都能得到分离，然而在 u-HPLC的实验条件下四种酸不能得到分离而且峰型也不好(下图A)，这些酸性化合物都是极性的，在 u-HPLC 的分离条件下有相近的保留时间。在柱两端施加电压后，从下图B上我们可以看到这四种负电荷酸的迁移时间增加，基于它们的电泳而得到分离。另外在p-CEC 上，总的分析时间明显减少，酸的峰型较 p-HPLC 得到了很大的提高。由于电渗流叠加到压力流上所以得到高分离速度。从下图B中可以看到系统峰(负峰)的死时间大约为7.5分钟，流动相的线速度是 20mm/min， 假定有半根柱填充有固定相，我们估计柱中的体积流大约为 177nL/min， 这点可以从梯度洗脱开始大约10分钟里的基线漂移中看出来。因此，系统的死时间大约是2.5分钟。这和低死体积连接产生的死体积一致。 泵流速对p-CEC的影响： p-CEC实验按以下条件进行：柱EP-75-21-3-C18；流动相A 0.005MKHPO4+0.0025M硼酸水溶液 pH=6.0；流动相B乙腈；梯度洗脱乙腈在10分钟里从 15%(v/v)加到80%；流速0.03ml/min； 电压2kV；压力1750psi； 进样量20nL；检测器UV@254nm；样品如下图所示： Figare 2. Smrucrure of 14 compounds 泵1流动相A与泵2的流动相B在混合体积为 2.2uL的混合器中混合。然后混合器里总的流量被分为两路，，一路流经进样器同毛细管柱，另一路从旁路流过相连的反压阀。化合物中的两个峰被用作计算泵的流速造成保留时间的改变，它们是在图3中的峰1和峰10。所有电色谱实验都被重复5次。计算结果在下表： 泵流速(uL/min) 峰1保留时间(min) RSD (%) 峰10保留时间(min) RSD (%) 10 17.537 0.32 20.371 0.39 20 16.037 0.17 18.665 0.20 30 15.311 0.67 17.928 0.62 40 14.633 0.22 17.397 0.11 50 15.209 3.15 17.989 2.20 从上表中可以看出，相同电压和泵压下，随着流速从 10pL/min 到 50pL/min 峰1和峰10的保留时间下降了11%，这是因为流速增加造成反压增加(因为反压阀的本身质量问题)结果在高流速下柱压增大。表1中的数据表明除了流速在 50uL/min 时的保留时间外，两个峰在梯度洗脱的条件下保留时间获得良好的重现。高流速(50uL/min)的重现性差可能是由于流动相A和流动相B的混合昆够充分。我们估计总的混合体积大约(混合器和连接管)在20ul，这对于从两个泵中混合 50pL/min 流速它的体积不够大。 电压对CEC分离的影响： 在恒压下增加电压，使得化合物的保留时间下降，这是因为 EOF随着电压的增加而增加。EOF 同压力流叠加所以流动相的总流速比纯压力驱动的流速大。电压对柱效的影响，以峰10为例，很明显随着电压的增加， p-CEC 的柱效先是增加，当电压大于6kV时，柱效随着电压的增加下降。 压力对 CEC 的影响： 在恒定的电压和恒定的流速下，人们研究了压力对柱效和分离度的影响。我们通过改变不同的反压系统，采取在进柱口上加 500-2500psi 的不同压力，可以认为当电压恒定时柱内的线速度随着压力的增加而增加。我们选中3对很难分离的化合物(峰2和峰3、峰4和峰5、峰6和峰7)来计算随着压力改变时的分离度，其结果见下表。非常明显，相同的电压和相同的泵流速下，随着压力的增大分离度增加。 压力(pis) 2、3分离度 3、4分离度 6、7分离度 500 - - - 750 0.62 0.68 1.08 1000 0.92 1.07 1.08 1500 0.99 1.43 1.61 2000 1.09 1.70 1.98 2500 1.24 2.2 2.6 然而，随着压力的增加柱效下降，。我们相信这种柱效的下降很可能是因为压力驱使的抛物线流型叠加到 EOF上。压力越高，抛物线流型对总的流型影响越大。 结论 我们发展并运用加压梯度 CEC 系统来分离哒嗪酮衍生物，用两个 HPLC 泵作为梯度溶剂的传输模块提供增加在毛细管柱电场外的压力。辅助的压力被用来改善稳定性和重现性，并克服焦耳热和产生气泡问题。除了它的溶剂梯度能力，本仪器结合了电驱动和压力驱动，易于选择性的调节而无需改变流动相的成分。本仪器的毛细管柱能实现三种分离模式(pCEC、u-HPLC和 CE)而且能很容易同质谱及其他小型化的检测器联用。