明胶中水解氨基酸检测方案

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Biochrom30+氨基酸分析仪检测明胶中酸水解氨基酸 样品前处理 1、 所用试剂 1、1 浓盐酸，，优级纯 1、2 6mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合 1、：3 水：：.去离子水 1、44 苯酚：须重蒸 1、、5 19种氨基酸标准品 行号 氨基酸 行号 氨基酸 1 Tau 牛磺酸 2 Asp 天冬氨酸 3 Thr 苏氨酸 4 Ser 丝氨酸 5 Glu 谷氨酸 6 Pro 脯氨酸 7 Gly 甘氨酸 8 Ala 丙氨酸 9 Cys 胱氨酸 10 Val 缬氨酸 11 Met 蛋氨酸 12 lle 异亮氨酸 13 Leu 亮氨酸 14 Nle 正亮氨酸 15 Tyr 酪氨酸 16 Phe 苯丙氨酸 17 His 组氨酸 18 lys 赖氨酸 19 Arg 精氨酸 20 2、 标样配置 氨基酸混合标准储备液：：含有天冬氨酸、苏氨酸等17种常见组成蛋白质的氨基酸。 牛磺酸标准储备液：：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成 2.5umol/L 的储备液备用。 正亮氨酸标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成 2.5umol/L的储备液备用。 将17种氨基酸混合标准储备液、牛磺酸标准储备液、正亮氨酸标准储备液及 PH2.2的柠檬酸缓冲液按照 1：1：1：7 配置成0.25umol/L的标准品待用。 3、 前处理设备 1) 天平 2) 水解管 3) 量筒 4 无油真空泵 5) 干浴水解、浓缩仪 6) 移液管 7 0.45um滤膜 4、 样品制备(参考国标GB/T18246-2000) 酸水解法： 称取含蛋白7.5-25mg的试样(约50-100mg，准确确0.1mg)，于20mL安培瓶中，加入10mL 6mol/L 盐酸置液氮中冷冻，然后，抽真空至<7Pa 后封口。将水解管放入干浴水解、浓缩仪中，110℃水解 22-24h， 冷却、混匀、开管、寸滤，用移液管取适量滤液，在干浴水解、浓缩仪中60℃吹干，必要时加入少许水，重复吹干1-2次，加入3-5mL PH2.2的稀释上机用柠檬酸钠缓冲液，是氨基酸浓度达到 50-250nmol/mL，混匀、过滤后上机。 分析方法描述(Biochrom 30+) 氨基酸分析仪分析方法参数： 1)色谱柱： Biochrom Na 型阳离子交换树脂柱，4.6×20cm 2))分离程序： NO. Time Temp Buffer Pump Nin Rec Commands 1 01：00 48 1 35.0ml/h ON OFF 2 00：00 48 1 35.0ml/h ON OFF Reset 3 01：00 48 1 35.0ml/h ON OFF Load 4 06：40 48 1 35.0ml/h 1ON ON 5 13：00 52 2 35.0ml/h ON ON 6 01：00 52 5 35.0ml/h ON ON 7 16：00 95 5 35.0ml/h ON ON 8 04：00 95 6 35.0ml/h ON ON 9 04：00 95 1 35.0ml/h 1ON ON 10 09：00 48 1 43.0ml/h OFF OFF 11 02：00 48 1 35.0ml/h ON OFF End 3))运行时间：经分析时间+再生时间 57min 4)反应单元温度：135℃。 5)检测波长：570nm、440nm 同时检测。 一、 外标法定量 1)19种氨基酸标准品谱图 2)进标样，拟合校正曲线，使用外标法软件自动算出每个氨基酸的含量。 3)样品中含量的计算公式 按照以下公式计算各个氨基酸在样品中的质量百分比： W-某种氨基酸含量 A-每毫升上机水解液中氨基酸含量， ng m一样品质量， mg D-样品稀释倍数 附、明胶分析图谱及做样结果 1000 1000 750 750 500 500 250 250 500 500 400 400 300 300 200 -200 100 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Minutes 570nm Results Pk# Name Retention Time Area ESTD concentration(%) 3 Tau 4.766 34967 0.046 6 Asp 8.033 4726820 5.886 7 Thr 9.633 1602458 1.737 8 Ser 10.433 3504559 3.237 9 Glu 12.533 7737708 10.143 11 Gly 18.465 32377564 20.706 12 Ala 19.499 10457945 9.210 14 Val 21.265 2133424 2.379 15 Met 23.099 171747 0.226 16 lle 24.565 924329 1.220 17 Leu 25.532 2356394 2.870 21 Tyr 28.298 269817 0.451 22 Phe 29.398 1288252 1.948 29 His 34.898 1239550 1.571 31 Lys 36.598 3408502 4.073 34 Arg 44.197 5145683 7.822 Totals 77379719 73.524 2 Pro 14.032 2579033 14.204 Totals 2579033 14.204