化学药中有效成分含量分析检测方案

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新型 SEC 色谱柱在分析单克隆抗体及多聚体中的应用 概要 为了检测蛋白类生物制剂的稳定性，降解试验研究是必要的。测试一种方法适用性的最好方式是使用实时稳定性样本，这种样本包含了随着时间可能出现的所有相关降解产物。然而，由于某些因素，比如产品开发时间线、工艺特征、辅料和其他环境因素，使得有必要进行强降解试验研究。蛋白质发生聚集现象是治疗性蛋白药物开发过程中的一个主要问题，即便是无毒的，这些杂质的存在也会降低药品制剂的药效。在生物制剂领域中被广泛使用的单克隆抗体蛋白，在将来具有取代小分子药物的潜力，所以去除单抗蛋白药物中的这些杂质变得至关重要。 为了全面评估这些多聚体，需要使用一种具有足够大的分子排阻界限的尺寸排阻色谱柱，这样，较大体积的多聚体不会超出排阻界限，而通过流体力学体积的作用被分离。本报告介绍了 TSKgel UltraSW Aggregate 色谱柱在分析单克隆抗体，以及在强制变性条件下(包括酸和热变性)形成的金属蛋白多聚体的分析实例，显示了色谱柱优异的分离性能。 分析条件 图1 色谱柱： TSKgel UltraSW Aggregate，3 pm， 30 nm，7.8 mm ID×30 cm流动相： 100 mmol/L 磷酸钾缓冲液，100 mmol/L硫酸钠， pH 6.7+0.05% NaNg流速： 1.0 mL/min检测： UV@280nm温度： 室温进样体积： 10 pL样本： mAb-02(客户提供)浓度：4.5 g/L， 溶于甘氨酸/磷酸钠溶液，pH6.0 图2 色谱柱：TSKgel UltraSW Aggregate， 3 pm， 30 nm，7.8 mm ID×30cm流动相：50 mmol/L 磷酸氢二钾，50mmol/L磷酸氢二钠，100 mmol/L硫酸钠，0.05% NaN3， pH6.7流速：1.0 mL/min 结果和讨论 图1显示了使用 TSKgel UltraSW Aggregate 色谱柱分析单克隆抗体酸变性而形成的抗体多聚体的分离效果。用稀磷酸稀释 mAb-02 样品溶液的 pH值到4.7后，分别在5，20和50分钟时取部分样本进行分析，并将峰响应值与原始样品溶液进行比较。单克隆抗体的降解产生了一个较大分子量的产物(未知)，它在二聚体洗脱后，单体洗脱前被直接洗脱下来。酸化使两个峰都继续增大，但是二聚体更为明显从图上清楚得可以看出，二聚体峰高增高而单体的峰高降低。三聚体或更高阶的多聚体在7-8分钟之间出现。 图1x对 pH 4.7条件下酸变形成的抗体多聚体进行分析 图2中所示为热变性，大分子疏水性金属蛋白，去铁蛋白的分析。使用6个分别含有100 uL 去铁蛋白储备溶液的0.3 ml HPLC 瓶用于进行蛋白质热变性的研究。使用电加热块在60℃条件下进行热变性研究。样品瓶盖紧，分别加热5，20，30，45和60分钟。在每个孵育时间段结束时用TSKgel UltraSW Aggregate 色谱柱分析样品。 TSKgel UltraSW Aggregate 色谱柱在单体和二聚体之间有很高的分离。度。去铁蛋白的三聚体，四聚体和更高阶多聚体之间的分离状况也十分良好。 结论 两次分析的结果均显示，使用TSKgel UltraSWAggregate 色谱柱分析单克隆抗体多聚体以及去铁蛋白变性而形成的大分子金属蛋白，具有很高的分离度。随着单克隆抗体在生物制药领域中使用越来越频繁，'TSKgelUltraSW Aggregate 色谱柱为多聚体检测提供了卓越的分析手段。 TSKgelUltraSW Aggregate 色谱柱(3 pm 粒径， 30nm孔径)采用了特殊的孔径设计技术，在典型单克隆抗体的分子量范围内可呈现良好的校准曲线。具有较大孔径，且排阻界限为~2×10°Da， 能提高 mAb 多聚体和低聚体分离的分辨率及定量。TSKgel UltraSW Aggregate 色谱柱是分析单克隆抗体蛋白多聚体(自然状态呈现或者强变性反应形成)的极佳选择。 Tosoh Bioscience 和 TSKgel 是东曹株式会社(Tosoh Corporation)的注册商标。 TOSOH BIOSCIENCETOSOH