氨基酸中柱前和柱后衍生高效液相色谱分析检测方案

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柱前衍生和柱后衍生高效液相色谱分析氨基酸方法的进展与评述美瑞泰克有限公司中国代表处整理 柱前和柱后衍生高效液相色谱分析氨基酸方法进展与评述 以下主要对两种类型的七种应用广泛的氨基酸分析方法进行介绍，讨论和研究。 1、柱前衍生技术和反向色谱分离 氨基酸→衍生物→色谱分离 1.1AQC(6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯)法 优点：能同时检测一级二级氨基酸，检出现1pmole 缺点：pH值和洗脱温度要求控制准确。 1.2 PITC(异硫氰酸苯酯)法 缺点： PITC试剂进入柱子使柱填料过早的老化，柱子寿命降低，因此过量的衍生剂需要真空干燥除掉，为此，仪器要附设衍生及真空干燥装置。(主要用在生物饲料及食品分析中应用) 1.3OPA (邻苯二甲醛-巯基乙醇) 缺点： OPA只能与伯氨反应，使二级氨不能同时被检测。由于反向柱分离过程中会有部分衍生物发生裂解，致使OPA-氨基酸的稳定性很差，尤其是胱氨酸和赖氨酸衍生物信号衰减较快，灵敏度低。 1.4 DANSYL-Cl(丹磺酰氯)法 优点：同时可以检测1，2级氨基酸同时能够准确的测定样品中的胱氨酸。 缺点：衍生物在紫外光下不稳定，特别是蛋氨酸对紫外光十分敏感，收率很低，因此衍生反应必须避光进行，而且反应最好要在室温下进行 40min左右，如果温度高于45度降低衍生物的产率。 1.5 FMOC-Cl(芴甲氧羟基氯)法 2柱后衍生技术和阳离子交换色谱分离 2.1 OPA(邻苯二甲醛-巯基乙醇)法 优点：程序化柱后衍生， OPA 以极快的速度于氨基酸反应成发荧光团物质，又在很短的时间内进入灵敏度很高的荧光检测器检测，消除了柱前手动衍生是衍生物不稳定的因素，该方法具有较高的分辨率和灵敏度。 2.2 Nin-hydrin(茚三酮)法 优点：程序化衍生，衍生反应速度快(60S)，衍生物稳定性好，衍生试剂能同时与一级和二级氨基酸反应并同步检测。 缺点：衍生物只能用紫外检测器检测，使灵敏度较低而不适合微量氨基酸测定；衍生反应条件要求较高，需要附设加温衍生装置，仪器造价高；流动相与衍生液同时泵入体系，体系平和时间较长长。 综上所述：经过改进和完善的柱后衍生，离子交换色谱法，仪器已具备很高的自动化水平，被分离出来的氨基酸在特有的诸侯氧化剂衍生设备中按固定程序与衍生剂迅速反应并被检测，消除了个样品由于衍生时间，衍生温度等因素的差异带来的测试误差，实践证明该方法是继稳定性分辨率，分离度具佳的可靠的氨基酸分析方法，而衍生试剂不直接计入色谱柱，使柱寿命延长时柱后衍生法的一明显优势。 柱前- -柱后衍生对照表 自动化程度 衍生物的稳定性 柱子的损害 前处理氨基酸 分析的种类 一次性设备投入 柱前衍生法 低 低 大 繁琐 18-26种 小 柱后衍生法 高 高 小 简单 22-45种 大