番茄、茄子、西葫芦、芹菜等7中蔬菜中新农药残留检测方案

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DIKMAA reliable partner for your lab QuEChERS-LC/MS/MS 快速分析蔬菜中7种新农药残留研究 闫实 辽宁省农业环境保护监测站，辽宁沙沈阳110034 摘要：研究建立了蔬菜中农药多残留的快速检测QuEChERS-LC/MS/MS 方法，优化了实验方案，样品以0.1%乙酸的乙腈(V/V)作为溶剂， DiKMA ProElut 提取试剂盒对样品进行 3min 提取后， 用 DiKMA ProElut 净剂试剂盒净化，缩短了检测时间、减少了溶剂用量，本研究方案每个样品溶剂用量仅为20ml， 每个样品的前处理费用大约为20元，，一一个实验人员每天可以处理60个蔬菜样品，真正实现农残的快速、简便、廉价、有效、灵敏、安全检测。结果表明：7种农药的平均回收率为72%~123%，相对标准偏差为2.3%~14.1%，检出限为 0.0009 mg·kg~0.016 mgkg。 关键词：农药多残留 样品前处理 液相色谱 串联质谱 民以食为天，食以安为先，我国对农产品质量安全非常重视，并于2006年颁布了《农产品质量安全法》，农药残留是农产品质量安全领域重点关心的问题。农业部2001年实施了“无公害食品行动计划”，每年对全国蔬菜的质量安全进行例行监测。今年是农产品质量安全监管年，农业部加大了监测力度，在原来检测基础上新增加7种农药残留的检测，为保证对蔬菜和水果的全程监控，迫切需要建立一种针对这7种农药的检测方法。 从样品前处理方法而言，目前的多农药残留检测方法只处于对单种农药残留检测或对几种农药残留的检测，并且检测过程费时费力，已经不适合日益要求严格的农药残留检测的要求。2003年美国科学家 Steven 就这些问题提出了分散固相萃取方法，即 QuEChERS (Quick， Easy， Cheap， Effective，Rugged and Safe)12-41. QuEChERS 方法被广泛的用于食品中的农药分析，具有方法的稳定性好，精密度高，添加回收率高，样品制备过程中所使用的仪器设备简单，所需空间小等优点。但是QuEChERS 方法是由国外学者提出，所以目前对此方法的研究大多数限于国外经常施用的农药，对于一些符合我国农情常用的农药比如烯酰吗啉、咪鲜胺等还鲜有研究。而且这种方法也有缺点，如净化效果不理想，提取效率较低。本文通过改进QuEChERS 方法中的提取和净化步骤，以农业部新增加7种敏感农药为研究对象，研究建立一种快速、简便、廉价、有效、灵敏、安全的多残留农药检测方法。 1. 材料与方法 1.1仪器与实验装置 ThermoTSQ Quantum Ultra |LC/MS/MS， 上海：021-61263966 重庆：023-62568657 T18 basic 型匀浆机，K600型食物调理机，高速离心机。 1.2试剂与材料 乙腈(农残级)， Dikma ProElut 提取试剂盒(6gMgSO4， 1.5 g NaOAc) 与Dikma ProElut 净化试剂盒(50 mg PSA， 50 mg C18， 150 mg MgSO4)或Dikma ProElut 净化试剂盒(50 mg PSA， 150 mgMgSO4)。甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、烯酰吗啉、咪鲜胺、嘧菌酯、、-二甲戊乐灵、噻虫嗪、氟啶脲标准品(农业部环境监测总站提供)。 1.3液相色谱则定条件 色谱柱： Dikma Endeavorsil 1.8 um 2.1 x 50 mm 溶剂：甲甲+缓冲盐溶液(0.01%甲酸+0.05%氨水)柱温：40℃ 梯度洗脱程序：0.0~1.0分钟甲醇比例10%， 1.0~6.0分钟甲醇比例升到90%，6.0~12.0分钟甲醇比例保持90%，12.0~12.1分钟甲醇比例降到10%，12.，1~15.0分钟甲醇比例保持 10%。 流速：250 uL/min 进样羊：5.0pL 1.4样品的前处理 1.4.1样品处理 将蔬菜先切成块，然后在食物调理机中加工样品，将加工好的样品装入聚乙烯盒中。 1.4.2样品提取 采用 Dikma ProElut 提取试剂盒(6gMgSO4、1.5g NaOAc)，向提取管中加加入10.0g蔬菜样品，再加入20.0 mL 1%醋酸的乙腈溶液，匀浆1.0 min，加入提取盐包，震摇离心管，使溶剂和粉末混匀，3700 rcf 离心3.0 min5. 1.4.3样品净化 转移少量上清液至合适的净化管中，根据蔬菜 色素的多少选择不同的 Dikma ProElut 净化试剂盒： 2 mL Dikma ProElut 净化试剂盒(50 mg PSA，50 mg C18 150 mg MgSO4、适合色素量多的蔬菜品种)或2mL Dikma ProElut 净化试剂盒(50 mgPSA， 150 mg MgSO4、适合色素量多的蔬菜品种)，涡旋震摇 1.0 min， 3700 rcf 离心2.0 min，分取0.20mL上清液，加入0.80mL高纯水。供LC-MS/MS分析。 1.4.4标准样品 基质加标校准法：按以上处理方法准备6个空白基质溶液，混匀，作为基质标样定容液。逐级稀释，使用基质标样定容液配制 50.0 ng/mL、20.0ng/mL、10.0 ng/mL、5.0 ng/mL、2.0 ng/mL、1.0ng/mL共6个浓度点，做基质加标校准曲线。 1.4.5准确度与精密度 为了考察方法的准确度和精密度，在各蔬菜样品中分别添加3个不同水平的农药混和标准液，按本研究方法进行测定，每个水平平行测定5次，计算方法的平均回收率和变异系数。 2.结果与分析 2.111前处理方案的选择 称取样品时称样量过大会整体增加实验成本、时间和溶剂用量，称样量过少影响样品检测代表性和准确性，经综合考虑最终确定称样量为10.0g. 在加入溶剂乙腈时加量过大会增加成本，污染环境，影响实验员身心健康，加量过少会影响提取效果，根据称样量确定溶剂添加量为20 mL. 蔬菜中含水量一般比较高，如果在样品中直接加盐可能引起放热反应，影响分析物的回收率。本研究选择在蔬菜样品中先加入溶剂匀浆后再加入提取盐包以防止无水硫酸镁过热引起回收率降低。 一些农药如甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟啶脲等活性较高，稳定性较差。本研究选择乙腈作为提取试剂，并且在其中加入0.1%的乙酸来掩蔽色谱系统的活性点6，，以改善峰型和响应值。 样品离心时离心时间过长会增加实验时间，离心时间过短会影响固液有效分离，最终确定离心时间以3.0 min 为宜。样品第二次离心时，考虑到样品经过初次离心已较为干净，而且净化管中的无水硫酸镁、PSA、C18较为纯净，最终确定离心时间以2.0 min。 北京：400-608-7719 上海：021-61263966 表1七种农药的特征离子对 农药名称 母离子 子离子 碰撞能量 锥孔电压 (m/z) (m/z) (v) 甲维盐 886.70 158 130 886.70 302.00 20 130 烯酰吗啉 388.14 301.00 22 105 388.14 165.00 34 105 咪鲜胺 376.21 308.00 14 105 376.21 266.00 18 105 嘧菌酯 404.12 372.12 14 106 404.12 329.11 32 106 282.09 212.00 11 95 二甲戊乐灵 282.09 194.11 18 95 282.09 119.07 25 95 噻虫嗪 292.15 211.10 14 96 292.15 132.05 24 96 氟啶脲 541.90 385.00 25 110 539.70 383.00 20 110 2.2选择离子对和碰撞电压的选择 选择离子对检测也称为 MRM， 它不是连续扫描某一质量范围，而是现将母离子打碎再选择地扫描它的几个特定子离子。MRM 扫描方式扫描的离子数少，选择性强，对每个离子的扫描时间长，能有效的过滤其它干扰物的离子，因此这种扫描方式的灵敏度很高，但这种扫描方式需要知道所要检测物质的特征离子对，适用于对特定化合物的样品检测。 特征离子对是指在谱图中能够反应化合物结构特征的一些离子对，包括母离子和特定子离子。究竟选择哪几个离子对作 MRM 扫描，则根据不同的分析要求决定，通常用一定浓度的标准溶液 Tune化合物的一级质谱条件，找到母离子的最佳质谱条件，然后对母离子进行打碎，优化碰撞能量，得到其特征性的子离子。最后用该离子对进行定性定量旧。表1为本方法所选择的农药测定的特征离子对。 综上所述，采用 Dikma Endeavorsil 色谱柱，合理的柱温，选择适当特征离子对和碰撞电压的MRM 扫描方式，分离效果较佳，峰型较好。图1给出了测定农药在本研究所选定条件下，采用 MRM扫描所得的色谱图。 2.3液质联用测定七种农药在五种蔬菜中的平均回收率和变异系数 根据以上研究得到的方法采用 MRM 扫描方式 测定了七种农药在五种蔬菜中的检出结果，见表2。 图1采用 MRM 扫描方式测定供试七种农药的色谱图 表2采用 MRM 扫描方式测定七种供试农药在五种蔬菜中的平均回收率和变异系数 农药名称 平均回收率(%) 变异系数(%) 蔬菜种类 番茄 茄子 西葫芦 芹菜 菜豆 番茄 茄子 西葫芦 芹菜 菜豆 甲维盐 75 78 79 71 82 5.3 4.2 3.1 12.4 9.5 烯酰吗啉 86 85 79 88 90 6.8 7.9 7.2 10.2 10.3 咪鲜胺 105 104 95 111 116 7.6 8.5 4.3 5.4 6.2 嘧菌酯 107 98 114 116 123 8.2 6.1 5.3 4.5 2.0 二甲戊乐灵 98 103 100 97 93 8.5 4.4 3.3 9.8 3.5 噻虫嗪 88 83 91 98 99 3.1 2.3 5.5 8.9 5.7 氟啶脲 72 86 78 77 85 9.3 11.3 14.1 10.9 13.5 2.4液质联用测定七种农药在五种蔬菜中的检出限 根据以上研究得到的方法采用 MRM 扫描方式测定七种农药在五种蔬菜中的检出限结果，见表3. 表3采用MRM扫描方式测定七种农药在五种蔬菜中的检出限/mgkg-1 蔬菜种类 农药名称 番茄 茄子 西葫芦 芹菜 菜豆 甲维盐 0.0041 0.0041 0.0060 0.0042 0.0035 烯酰吗啉 0.0039 0.0031 0.0021 0.0037 0.0033 咪鲜胺 0.0022 0.0016 0.0013 0.0035 0.0018 嘧菌酯 0.0015 0.0014 0.0009 0.0013 0.0014 二甲戊乐 0.0011 0.0017 0.0016 0.0015 0.0014 灵 噻虫嗪 0.0012 0.0014 0.0015 0.0016 0.0018 氟啶脲 0.0082 0.016 0.0098 0.015 0.011 从上述结果可以看出通过 MRM 扫描方式，七种农药在五种蔬菜中回收率最低为72%，最高为123%；变异系数最低为2.3%，最高为14.1%；检出限最低为0.0009mgkg，最高为0.016 mgkg；完全符合蔬菜中农药残留检测的要求。 3.讨论 择离子对、碰撞能量和锥孔电压进行分析和优化，最终选择最佳串联质谱条件，优化了实验方法。建立了蔬菜农药多列留 QuEChERS-LC/MS/MS 的快速筛选、定量及确证的分析方法，和消耗溶剂量大，费时费力的传统处理方法不同，本研究仅用20ml含 0.1%的乙酸乙腈提取、采用 PSA 和 C18高速离心净化的前处理方法，并在此基础上选择 DiKMAProElut 成品的提取试剂盒和净化试剂盒，并对QuEChERS 方法中的提取和净化步骤进行改进，缩短了实验时间，减少了溶剂用量，简化了实验步骤，降低了实验成本，减少了有机溶剂对检测人员的身体伤害。一个检测人员每天可以处理60个蔬菜样品，每个样品的前处理费用大约为20元。 4.结论 将 QuEChERS-LC/MS/MS 方法应用于蔬菜中的多农药残留的分析，结果表明：：方法回收率在72%~123%之间，相对标准偏差在 2.3%~14.1%之间。该方法具干扰目标物检测的杂质少，溶剂用量小、操作简便、快速等特点。可满足国内及对外出口蔬菜农产品的农残监测分析，将是各实验室常规检测农药多残留物的首选方法。 相关产品信息 货号 名称 规格 样品前处理 64520 ProElut QuE AOAC 萃取盐 6 g MgSO4，1.5g NaOAc， 50/pk 64501 ProElut QuE 2 mL 净化管-AOAC 50mg PSA/ 150 mg MgSO4 100/pk 64505 ProElut QuE 2 mL 净化管-AOAC 50 mg PSA/ 50 mg C18/ 150 mgMgSO4 100/pk 色谱柱及保护柱 87002 超高效液相色谱柱 Endeavorsil C18 1.8 pm 50x2.1 mm 标准品 12-N-12920-100MG 甲维盐[155569-91-8] 100 mg 12-N-11759-100MG 烯酰吗啉[135410-20-7] 100 mg 46122 咪鲜胺[67747-09-5] 100 mg 46110 密菌酯[131860-33-8] 100 mg 46022 二甲戊乐灵[40487-42-1] 100 mg 12-N-13562-100MG 塞虫嗪[153719-23-4] 100 mg 12-N-11430-50MG 氟啶脲[71422-67-8] 50 mg HPLC溶剂•缓冲盐•离子对试剂 50139 乙腈P.R.级 4L 50102 甲醇HPLC级 4L 50144 甲酸 HPLC 级 50 mL 通用色谱产品 52401B 瓶架/蓝色 50孔 52401A 瓶架/白色 50孔 5323 样品瓶(棕色/螺纹) 2 mL，100/pk 5325 样品瓶盖/含垫(已经组装) 100/pk H80465 HPLC 进样针 25 uL 天津： 广州：南： 青岛：京：阳：都：家庄： 天津： 广州：南： 青岛：都：阳：庆：家庄：