腊肉香肠中苯并芘检测方案

智能文字提取功能测试中

2 样品及加标样品色谱图(加标量为 5 pg/kg) 冉良骥金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 在线固相萃取；高效液相色谱；荧光检测；多环芳烃 目的 利用双三元液相色谱仪，通过在线固相萃取建立腊肉香肠中苯并[a]芘的检测方法，在现行国家标准基础上，进一步简化前处理方法、并确保分析过程更加灵敏、快速、准准。 引言 苯并[a]芘(英文缩写 BaP)属多环芳烃类化合物，是一种常见的高活性间接致癌物质(结构式见图1)。 食物中的 BaP 通常源自加工过程，当食材经高温处理时，所含的氨基酸和油脂类成分可通过裂解或热聚合生成BaP，若加工温度较高(如400~1000℃)， BaP生成量将会急剧增加。由于腊肉、香肠等制品通常会经过烘烤或烟熏处理，生成BaP的可能性相对较大，因此需要对其所含的 BaP 加以严格控制。目前我国国标限定粮食和肉制品中Bap 的残留量应在5 ug/kg以下，相应的国家标准及文献方法如表1所示。 表1.肉类产品中苯并[a]芘的前处理方法 方法出处 样品基质 检出限(ug/kg) 前处理方法 分析方法 农业行业标准 肉制品 0.5 环己烷超声提取3次 高效液相色谱法 NY/T 1666-2008 (烧烤、烟熏) 液液萃取净化 (荧光检测器) 甲醇-氢氧化钾皂化 30min正己烷提取 水产行业标准 水产品 未提供 高效液相色谱法 SC/T 3041-2008 固相萃取住净化 (荧光检测器) 国家标准 食品(肉类) 1 环己烷提取6~8小时 GB/T5009.27-2003 固相萃取净化 纸色谱分离，溶剂浸出 荧光分光光度法 腊肉 0.15 文献 70℃皂化2.5小时 高效液相色谱法 正己烷超声提取 (荧光检测器) 经比较发现，上述方法的前处理过程均较为繁琐，耗时较长，不便于大量样品的快速检测。本方法使用双三元高效液相色谱系统(DGLC-3600)，采用在线固相萃取(On-line SPE)技术，首羊将样品中难洗脱的动物油脂等成份保留在富集柱上(在线净化)，然后通过切换阀将易洗脱的目标物转入分析柱进行 HPLC 分离，从而有效降低基质成份对目标物的干扰。该方法可实现样品自动化前处理，方法快速简便(测试周期约为30 min)，灵敏度高(检测限按供试品取样量折算可达0.15 ug/kg)，且精密度和回收率好，适于大批次样品的快速检定； SPE 小柱可在分析过程中在线净化，重复使用，大大节省测试成本。 仪器 高效液相色谱仪(Thermo Scientific Dionex Ultimate DGP 3600系列，包括有带在线脱气单元的双三元梯度泵，自动进样器，带有一个六通阀的柱温箱，荧光检测器，仪器连接参见图2。) 超纯水机 (Thermo Scientific GenPure Pro UV-TOC， P/N： 50131948)台式离心机(Thermo Scientific Sorvall ST16， P/N： 75004240)旋转蒸发仪 (Thermo Scientific RV10V， P/N： IKA8022525)匀浆机(Seward Stomacher 80， P/N： SWD0080/000/EU) 试剂和对照品 甲醇(色谱纯， Fisher Chemical， P/N：A452-4) 乙腈(色谱纯， Fisher Chemical， P/N：A998-4) 乙酸乙酯(色谱纯， Fisher Chemical， P/N： E195-4) 无水硫酸钠(分析纯， Fisher Chemical， P/N： S429-500)苯并[a]芘标准品( Dr. Ehrenstorfer GmBH， 99.6%) 富集、分析活化过程 标准品溶液制备 ( 称取苯并[a]芘标准品 5.39 mg， 置100ml 棕色量瓶中， 以 甲醇溶解定容至刻度；再精密量取该溶液1.0ml，以甲醇稀释定容至50ml， 作为标准品储备液(浓度1.074 ug/ml)。取标准品储备液以甲醇逐级稀级为浓度分别为53.89、 10. 7 4、5.376 、 1.06 8 、0.534、0.107 ng/ml 的标准工 作 溶液。 ) 样品溶液制备 取样品，以绞肉机搅碎混匀后，准确称取2.0g， 加入无水硫酸钠2.0g，置50ml离心管中，先后以乙酸乙酯20 ml 均质提取2次，每次1min， 然后于8000转/分下离心2min；合并两次上清液，于55℃下旋转蒸发浓缩至2ml以下，以乙酸乙酯转移至10ml量瓶，定容至刻度，过0.45 pm有机滤膜后待测。 加标溶液制备 取搅碎后样品2.0g，准确加入1ml标准品溶液，氮气吹干后，照样品溶液制备法“加入无水硫酸钠2.0g…..”及后续方法操作，即得。 色谱条件 分析柱： Acclaim Phenyl-13 pm， 4.6 ×150mm (P/N： 071969，S/N： 001059) 富集柱： Acclaim C8 5pm， 4.6×10mm (P/N： 069696，Lot No： 101111) 流动相：流动相组成见表2；富集泵梯度及阀切换条件见表3流速：富集泵1.0ml/min；分析泵1.0ml/min进样量：10pL柱温：35℃荧光检测器：激发波长290nm， 发射波长410nm， 灵敏度1 转移过程 图2.仪器连接图 表2.淋洗液组成及流速 富集泵(左泵) 分析泵(右泵) 乙腈 流动相A 等度洗脱 流动相B 乙腈-水(80：20) 水 乙酸乙酯 流动相C 表3.富集泵(左泵)梯度淋洗条件 时间(min) B% C% 阀位置 备注 0 20 0 1-2 进样、富集柱富集，开始信号采集 0.3 20 0 6-1 阀切换，将苯并[a]芘转载至分析柱 1.8 20 0 1-2 阀切换， SPE 柱切回到富集流路 2.0 20 0 1-2 等度洗脱 2.5 0 75 1-2 梯度洗脱，将高保留的油脂成份从 11.5 0 75 1-2 SPE 柱上快速洗脱，活化色谱柱 12 20 0 1-2 平衡色谱柱，为下一针进样做准备 15 20 0 1-2 分析完成 结果与讨论 标准品色谱图(1.068 ng/ml) 图3.标准品测定色谱图 图4.样品及加标样品测定色谱图(上-样品；下-加标样品) 样品前处理方法优化 分别采用乙腈、异丙醇、乙酸乙酯、正己烷对样品进行提取，结果发现乙腈、异丙醇提取效率较低(回收率仅50%)；正己烷极性太小，制得的供试品溶液油脂含量较大，可能导致固相萃取柱过载，且正己烷挥发性过强，可能影响进样精密度；而采用乙酸乙酯提取，回收率相对较好，富集泵可对 SPE 小柱有效净化，减少不同样品间干扰；加入无水硫酸钠可对样品溶液进行脱水处理，进一步减少干扰。 色谱柱选择 富集柱选择：为了尽可能减少油脂成份在 SPE 小柱上的洗 脱时间，提高分析速度，优选 Acclaim C8 作为在线 SPE 柱。分析柱选择：分别选择 Hypersil Gold C18、Accucore C18、Acclaim Phenyl-1 色谱柱对样品和对照进行分离，结果发现Acclaim Phenyl-1(苯基柱)分析，苯并[a]芘峰形最好，与其他杂峰的分离最佳，故最终选择 Acclaim Phenyl-1 色谱柱作为分析柱。 方法的重现性 取浓度为 1.068 ug/ml 的对照品溶液重复进样5针，保留时间 RSD 为 0.04%，色谱峰面积 RSD 为 0.96%。制备加标量5 ug/kg 的供试品溶液5份，分别进样1针，保留时间 RSD 为0.07%，色谱峰面积 RSD 为 2.40%。 图5.加标样品重复性测定色谱图 线性、检出限 取不同浓度苯并[a]芘标准工作溶液依次进样10pl分析，在 0.107 ng/ml ~ 53.89 pg/ml苯围，以苯并[a]芘浓度和峰面积进行线性回归，标准曲线为A=8254.2783 C+ 208.3219，相关系数1.0000。 取浓度为0.107 ng/ml的苯并[a]芘对照品溶液，进样3pl分析，苯并[a]芘峰高值约为噪音值三倍，本方法检出限为0.3 pg(按对照品进样量折算)；最低检出浓度为 0.15 pg/kg(按供试品取样量折算)。 图6.方法检测线测定色谱图 实际样品的分析 取市售的样品，分别照 GB/T 5009.27-2003 和本方法进行测 试，结果见表4。 表4.样品检测结果 序号 基质 检测结果(ug/kg) 国玉 GB/T 5009.27-2003 l本方法 1 腊肉 N.D 0.98 2 香肠 N.D 0.49 3 香肠 N.D 1.36 4 腊肉 N.D 0.53 腊肉 N.D N.D 取5#样品进行加标回收试验(色谱图见图5)，加样回收率均在95%~105%之间，平均回收率为98.51%， RSD=2.40%(n=5)，说明本方法的准确度较高；采用国家标 准 GB/T 5009.27-2003(提取净化后的样品溶液采用纸色谱分离，荧光分光光度计测定)未能检出样品中苯并[a]芘，初步推测是由于该方法灵敏度相对较低所致。 本方法使用在线固相萃取方法对腊肉香肠中苯并[a]芘进行测定，操作简便易行，减少了手动操作步骤，提高了方法重现性和准确度，适用于该类样品的快速检测。 ( [1]农业行业标准 NY/T 1666-2008肉制品中苯并[a]芘的测 ) ( 定高效液相色谱法 ) ( [2]水产行业标准 SC/T 3041-2008水产品中苯并[a]芘的测 定高效液相色谱法 ) ( [3]国家标准 GB/T 5009.27-2003食品中苯并[a]芘的测定 ) ( [4]李念念，周光宏等，高效液相色谱一荧光法测定腊肉 中的苯并花残留[J]食品工业科技，2013，34 ( 1)：319-322 ) 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 免费服务热线：8008105118400 6505118(支持手机用户) ThermoFisherSCIENTIFIC AN_C_LC-