化学药中特殊物质和基团检测方案

智能文字提取功能测试中

「应用纪要THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要] Waters 盐酸莫西沙星注射液中杂质的检测及结构鉴定 王志英 应用优势 使用亚2um色谱柱，分析时间由60 min缩短至25 min， 提高了分析效率。 使用XevoG2-SQTof能得到准确的分子量，其质量偏差在0.8mDa以内。 通过MassLynx@及MetaboLynxM软件快速自动进行杂质解析，节省人力及时间。 沃特世解决方案 ACQUITY UPLCXevo G2-SQTof质谱仪 MassLynx、MetaboLynx软件 HSS T3(100*2.1mm，1.8um)色谱柱 关键词 UPLC、QTof、杂质鉴定、MassLynx、MetaboLynx、莫西沙星 前言 莫西沙星(Moxifloxacin)为人工合成的喹诺酮类抗菌药，是一类较新的合成抗菌药。具有抗菌性强、抗菌谱广、不易产生耐药性，并对常见耐药菌有效、半衰期长、不良反应少等优点。临床上用于治疗呼吸系统感染、生殖系统感染、皮肤软组织感染等。莫西沙星原研厂家为德国拜耳，其注射剂在中国的专利保护期即将到期，国内也有多个厂家正在进行莫西沙星的仿制。但如今基于药品安全的考虑，仿制药中的有关物质的检测越发引起注意，中国药典上也明确规定，药物中杂质，含量高于0.1%的所有杂质均需对其杂质结构进行鉴别(毒性药物限度则更低)。所以，如何高效快速地测定药物中的杂质，这一课题逐渐成为药物研究过程中亟待解决的难点。 本文采用沃特世(Waters@)超高效液相色谱目行时间质谱(ACQUITY UPLC/Xevo G2-SQTof)联用技术对莫西沙星注射液(光照10天)样品中杂质进行分析，采用亚2um色谱柱UPLC方法，使整个分离时间由60分钟缩短至25分钟，且杂质得到有效分离；应用MassLynx和MetaboLynx软件，自动得到包含各个杂质分子量、分子式、及结构信息的杂质列表，使整个杂质鉴定过程高效快速、节省人力。 图1.莫西沙星(Moxifloxacin)CHFN0。 实验条件 样品制备：莫西沙星注射液(光照10天)样品直接进样。 A.LC/UPLC条件 LC系统： ACQUITY UPLC 色谱柱： HSST3(100x2.1mm， 1.8pm) Part No.： 186003539 柱温： 35C 进样量： 1pL 流速： 0.45mL/min 流动相： 水(850mL)/乙腈(150mL)/醋酸(30mL) B. MS条件 MS系统： Xevo G2-S QTof 离子化模式： ESI+ 毛细管电压： 2.0 KV 源温度： 120°C 雾化气温度： 550°C 雾化气流速： 800L/h 锥孔气流速： 50L/h 采集模式： MSE C.PDA检测器 紫外检测波长： 293nm D.软件MassLynx、MetaboLynx 实验流程 图2.实验流程图。 结果与讨论 使用方法转换器及色谱柱选择卡，将客户提供的HPLC普通液相平行转化为UPLC方法，如表1。图3为客户使用HPLC得到的紫外谱图，图4为转化为亚2 um色谱柱后得到的紫外谱图。从结果可看出，分析时间由60分钟缩短至25分钟，流速由1.0mL/min降低到0.45 mL/min， 使用UPLC可提高效率、大大节省成本；同时，从谱图的分离度及响应来看， UPLC的分离度更好，响应更高(进样量由5uL降为1 pL)。其中谱图中红色箭头处几个大峰为我们特别关注的杂质。 表1.将样品检测方法转化到亚2um色谱柱上进行分离 分析条件 HPLC方法 UPLC方法 色谱柱 Cig，4.6*150 mm， 3.5um HSS T3， 100*2.1 mm， 1.8 um 流速 1.0 mL/min 0.45 mL/min 进样量 5uL 1uL 分析时间 60 min 25 min 图3.客户使用HPLC得到的紫外谱图。 图4.转化为亚2um色谱柱后得到的紫外谱图。 与液相紫外相连的为Xevo G2-SQTof质谱，采用MS这种简单实用的专利技术采集样品，可以实现样品进样一次同时得到一级质谱图和丰富的离子碎片信息，其中包括了母离子扫描、子离子扫描和中性丢失扫描的结果，并且避免了杂质信号的丢失。如图5为一针进样同时得到莫西沙星注射液(光照10天)样品的一级质谱总离子流图、二级质谱总离子流图。图6为主峰的一级和二级质谱图。 图5.一针进样即可得到莫西沙星注射液(光照10天)样品的一级质谱及二级质谱总离子流图。 图6.主峰的一级质谱图和二级质谱图。 采用MassLynx软件，通过准确的质量数和同位素匹配确定分子式，之后再根据二级卒片质谱对结构进行确认。以主峰峰例说明判断分子式的过程，如图7确认分子式。再通过软件MassFragment功能对二级碎片进行自动解析，如图8，可看出，其碎片的精确度也非常好，质量偏差很小。 图7.通过准确的质量数和同位素分布来确定分子式(以主峰为例)。 图8.通过准确的质量数和同位素分布来确定分子式(以主峰为例)。 使用MetaboLynx对杂质进行自动解析，其解析结果界面如图9，可以自动得到杂质列表，其中包含分子量、分子式、质量偏差、峰面积及其结构信息。软件还自动显示每个杂质在样品中的提取离子流图、在空白中的提取离子流图、一级质谱图和二级质谱图，使杂质的分析更明确。通过此软件可快速得到其整个样品谱图上所有杂质的信息，具体如图10显示。其中从“质量偏差(mDa)”可看出由Xevo G2-S QTof可获得很好的质量精度，其质量偏差在0.8mDa以内。“杂质与母药关系”一栏，可快速获得其结构的相关信息。如写“Hydroxylation”即“主峰的结构+0”，，“Hydroxylation+ desaturation ”即“主峰的结构+0-H，”。另外出现如(R_0：-CH，)等“R_”的形式是指软件自动对主峰进行烷基化断裂后的结构(软件已自动给出结构)，如“Hydration-CH， (R_0：-CH，)”即指“主峰-CH2后的结构再+H，0-CH，”，其结构也已呼之欲出。 图9.MetaboLynx对杂质进行自动解析的界面。 杂质数 保留时间(min) 分子量 杂质与母药关系 分子式 与母药的质量 m/z|+H| 416.1623 质(量偏差mDa) 0.2 峰面积 (MS) 1 2.06 415.1543 433.1649 447.1442 C21H22FN305 C21H24FN306 C21H22FN307 13.9794 31.9905 45.9699 15.994629.9744 434.1734 0.70.8 28215.431281.394660.824078.7 2 4 5 2.06 2.27 448.1528 418.1775 -0.30.2 -37.1044 541861.121339.3 6 7 2.97 431.1493 8 3.18 413.1587 Quinone formation Quinone formation-F+H (R 2：-F+H) C21H22FN306 29.9743 432.1571 0 40682.5144555.6 C21H23N306 11.984 414.1669 0.4 9 3.28 325.0598 3 x Hydroxlation-C7H12N2 (R_5：-C7H12N2) C14H12FNO7 -76.1153 326.0676 13489.6 10 3.60 417.1700 Hydroxylation C21H24FN305 15.9952 418.1781 0.3 35315.7 1112 4.084.45 417.1700417.1700 Hydroxylation Hydroxylation C21H24FN305C21H24FN305 15.994615.9951 418.1775418.178 -0.30.2 29776.513750.1 13 4.50 429.1536 Quinone formation+ Oxidative Defluorination C21H23N307 27.9785 430.1614 0 51941.1 1415 5.30 415.1543 Hydroxylation + desaturation C21H22FN305 13.9786 416.1615 -0.6 37645.7 1516 5.57 361.1438385.1438 C18H20FN304C20H20FN304 -40.0309-16.0317 362.152 0.4-0.4 13956.916024 17 5.78 Desaturation-CH2(R_0：-CH2] 386.1512 5.835.946.056.05 401.1387415.1543373.1802405.1700 -0.036413.9792-27.9949 402.1465416.1621374.188406.1775 0-0.3 20389.5164162.6 2021 22 DecarbonylationHydration-CH2 (R O：-CH2) Decarbonylation-CH2(R_0：-CH2) 231287.679747.669515.3 6.52 8.01 359.1645 279.0543 C19H22FN303C13H10FNO5 3.994642.0112-122.1215-1.9965 360.1717280.0614 -0.6-0.7-0.8 19689.1140767.3 23 8.64 11.62 15.995214.0152 400.1864418.1781 0.3 57685 26 15.76 415.1743 C21H25N306 13.999 416.1981416.1819 -0.4-0.2 192541.752295.1 Hydroxylation + Oxidative Defluorination 27 18.20 397.1638 Oxidative Defluorination + Desaturation C21H23N305 -4.012 -109.0892 398.1709 293.0938 -0.7 0 18.73 292.0859 C14H13N204F 图10.通过软件自动得到的莫西沙星注射液(光照10天)样品杂质列表，包含杂质峰m/z、保留时间、分子量、分子式、质量偏差、峰面积及具体的结构信息等。 客户特别关心的三个大峰紫外谱图中5.93 min、8.60 min、18.68 min的杂质信息如表2。其中5.93 min和8.60 min的峰包含有多个杂质，未完全分开。从图11中， RT 5.93 min的一级质谱图可看出： m/z 187.5981为带了双电荷的分子离子，与m/z374.1880为同一化合物，且m/z 374.1880的含量较高。图12可以看出，200.5981为带了双电荷的分子离子，与400.1866为同一化合物，此杂质浓度较高。图11、12、13分别列出了这三个色谱峰的一级质谱图、每个杂质组分的二级质谱图及可能的结构。 表2.客户关心峰的杂质信息 紫外谱 图中保留时间 保留 时间 分子量 杂质与母药关系 分子式 m/z[+H+] 质量偏差 (mDa) (min) (min) 5.94 415.1543 Hydroxylation + desaturation +0-H， CHENO， 416.1621 0 5.93 6.05 373.1802 Decarbonylation -CO C，0H，FNO 374.188 0 6.05 405.1700 Hydration-CH，(R_0：-CH，) +H，0-CH， C，OH，FN.0 406.1775 -0.3 8.60 8.64 399.1794 Oxidative Defluorination -F+0H CHNO， 400.1864 -0.8 8.70 417.1700 Hydroxylation +0 CHFNO， 418.1781 0.3 18.68 18.73 292.0859 CHNOF -C，HN CHNOF 293.0938 图11.紫外谱图中RT5.93 min峰包含的杂质一级及二级质谱图及可能结构。 图12.紫外谱图中RT8.60 min峰包含的杂质一级及二级质谱图及可能结构。 图13.紫外谱图中RT 18.68 min峰包含杂杂质一级及二级质谱图及可能结构。 结论 本实验将常规HPLC色谱柱检测方法平行转化为亚2 um的UPLC色谱柱检测，分析时间由60 min缩短至25 min， 大大提高分析效率，同时流速由1 mL/min降至0.45 mL/min， 节约了溶剂成本。分离度及出峰情况与原谱图保持一致。应用Xevo G2-SQTof能得到最准确的分子量，其杂质质量偏差在0.8mDa以内，同时利用MeteboLunx智能软件，快速得到包含所有杂质峰m/z、保留时间、分子量、分子式、质量偏差、峰面积及具体结构信息的杂质列表，提取离子流图、一级和二级质谱图等信息，大大节省人力及时间。通过此杂质列表及质谱图可得到杂质的可能结构，再通过MassFragment功能对杂质二级碎片结构进行匹配进而确定杂质结构。从此推断流程可看出，在高效的UPLC、精准的QTof仪器及强大的智能软件帮助下，复杂的杂质结构鉴定工作变得更简单轻松，对人员的经验、资历背景依赖性降低，大大节省人力、物力和时间成本，对于药物的有关物质研究工作起到积极的推动作用。 Waters THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters， Xevo， MassLynx， ACQUITY UPLC， UPLC和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。 上海：021-61562666 成都：028-65784990 香港：852-29641800 酸莫西沙星注射液中杂质的检测及结构鉴定