缬沙坦中基因毒性杂质检测方案(液相色谱仪)

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[应用纪要]WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [案例十二] UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro 快速分析缬沙坦中多种基因毒性杂质张晓晓，方红，于雁灵 实验方法 色谱系统： ACQUITY UPLC IClassi 色谱柱： ACQUITY CSH氟苯基，1.7um， 2.1x100mm； 流动相： A： 0.1%FA水；B：甲醇； 柱温： 40℃ 进样体积： 10pL 质谱系统： Xevo TQ-S micro 电压： 0.5kV(ESI+)，0.5pA(模 拟APCI+，下文标记 为"APCI"+) 脱溶剂气温度： 600℃ 脱溶剂气流速： 1000L/h 数据采集方式： MRM 超高效液相色谱与高灵敏度的串联四极杆质谱联用，为药物制品中相对含量更低的基因毒性杂质的检测提供了高灵敏度、高选择性的分析检测方案。本文使用Waters系统标配的ESCi多功能源建立一种同时检测NEIPA、NDIPA、NDMA、NMBA、NDEA 5种亚类胺类基因毒性杂质的快速分析方法，分析时间6 min。 如下图，ESCi电离源是沃特世串联四极杆系统标配的多功能电离源，具有ESI独立工作模式、模拟APCI独立工作模式、及ESI和模拟APCI交替工作模式，因此称作"大气压电离复合源"。可实现一针进样，同时得到ESI±和APCI±四张谱图；免工具安装，使用方便、维护简单。 ESCi大气压电离复合源图片 实验样品及前处理 缬沙坦样品(缬沙坦胶囊，规格：内容物175mg含缬沙坦80mg)； 样品前处理方法：去取缬取坦样品(胶囊内容物)5 mg， 加入50pL甲醇和950pL水，涡旋、超声、离心，取上清过滤上样。 实验结果 杂质与主成分的色谱分离 基因毒性杂质相对于主成分杂质含量往往较低，故色谱分离的重点是将杂质与主成分进行有效分离，然后将高含量的主成分切至废液。 图1为API与待检测的5种基因毒性杂质的色谱分离图谱。由图可知，主成分与5种待测杂质可以有效分离，所以，使用Waters质谱仪器内置的阀切换系统，在MRM采集方法中设置0~4 min进质谱检测，4min后排至废液，以降低制剂中超高含量的原料药(缬沙坦)对质谱锥孔的污染。 图1.杂质与主成分的分离色谱图 方法专属性考察 空白溶剂(5%甲醇水)、实际样品及样品加标溶液的检测色谱图如下图2，可见该分析方法专属性符合要求，无溶剂等干扰。 图2.空白溶剂(左，5%甲醇水)、实际样品(中)及样品加标回收(右)色谱图 方法的灵敏度、工作曲线与数据重现性 5种亚硝胺基因毒性杂质方法学数据见表1，在0.1-100 ng/mL线性范围内线性相关系数R²均大于0.999，分别选取低中两个浓度点0.2 ng/mL、1ng/mL考察稳定性，连续6针进针， RSD%1.5-8.6%之间，符合要求。 灵敏度与线性范围 数据重现性(n=6， RSD%) 杂质名称 电离方式 LOQ 线性范围 相关系数 QCL ( 0.2 ng/ QCM (1.0 ng/ (ng/mL) (ng/mL) B² mL)RSD% mL) RSD% NEIPA ESI+ 0.2 0.1~100 0.999 1.56 3.49 NDIPA ESI+ 0.2 0.1~100 0.999 4.42 4.16 NMBA ESI+ 0.2 0.1~100 0.999 3.5 1.72 NDMA "APCI"+ 0.2 0.1~100 0.999 5 3.74 NDEA "APCI"+ 0.2 0.1~100 0.999 8.63 3.65 表1.杂质分析方法学结果汇总 加标样品回收率考察 加标回收率的考察：在样品中添加标品使得5种化合物添加浓度为1ng/mL， 前处理方法去样品，加标回收实际测定值及加标回收率如表2.，均符合要求。 第一次测试 第二次测试 化合物 胶囊中含量 (Sample1) 加标1ng/mL 后检测浓度 回收率 胶囊中含量 (Sample2) 加标1ng/mL后 检测浓度 回收率 (%) 平均回收率 (%) NEIPA ND 0.885 88.5% ND 0.99 99% 93.25% NDIPA ND 0.82 82% ND 0.935 93.5% 87.75% NMBA ND 0.865 86.5% ND 0.915 91.5% 88.75% NDMA 1.06 1.94 88% 0.97 2.06 109% 98.5% NDEA ND 87.5% ND 0.895 89.5% 88.5% 表2.缬沙坦样品及加标回收考察结果 样品测定 按样品前处理方法，取上清过滤上样；如表2，测得缬沙坦样品中NDMA含量约为1.0 ng/mL， 相对于胶囊制剂含量0.2 ppm； 其余四种亚硝胺均未检出，说明其含量低于目前检测方法的检出限(即相对含量0.04ppm)。 FDA官网要求如下表3，缬沙坦胶囊中NDMA限量标准为0.3 ppm，NDEA， NMBA分别为0.08 ppm， 0.3ppm。经初步测定及结果比对，此样品中NDMA、NDEA、NMBA均低于FDA限量要求，即符合标准，不需要召回。 Interim Limits for NDMA，NDEA，and NMBA in Angiotensin II ReceptorBlockers (ARBs) Drug MaximumDaily Dose(mg/day) AcceptableIntake NDMA(ng/day)* AcceptableIntake NDMA (ppm)** AcceptableIntake NDEA (ng/day)* AcceptableIntake NDEA(ppm)** Acceptable Intake NMBA(ng/day)* AcceptableIntake NMBA(ppm)** Valsartan 320 96 0.3 26.5 0.083 96 0.3 表3.FDA官网公布的缬沙坦中NDMA、NDEA、NMBA的限量标准( https：//www.fda.gov/drugs/drug-safety-and- availability/fda-updates-and-press-announcements-angiotensin-ii-receptor-blocker-arb-recalls-valsartan-losartan) 讨论 ESCi多功能源是沃特世专属并标配的离子源，除了ESI独立工作模式外、它还有模拟APCI独立工作模式及ESI和APCI交替工作模式，用多功能源中的模拟APCI功能，用户无需另配APCI探针，只需插入一根电晕针即可实现，方便快捷。 本方法基于UPLC-TQ-S micro系统，通过使用系统标配的ESCi多功能源建立了6 min内一针进样，实现5种亚硝胺类基因毒性杂质测定的方法。针对不同化合物在不同电离模式下灵敏度不同的特点，在一个方法中，实现ESI与"APCI"电离模式的切换，取长补短，达成该5种亚硝胺化合物的同时分析，并确保不同化合物皆有较好的灵敏度。 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 香港：852-29641800 ( Wat er s和The Sci e nce of What's Possible是沃特世公司的商标 。 所有其他的商标属于各自的所有者。 ) ( ◎20 1 9沃特世公司2019年6月 ) 免费售后服务热线：800(400)820 2676www.waters.com PLCI-Class/Xevo TQ-S micro 快速分析缬沙坦中多种基因毒性杂质 简介 超高效液相色谱与高灵敏度的串联四极杆质谱联用，为药物制品中相对含量更低的基因毒性杂质的检测提供了高灵敏度、高选择性的分析检测方案。本文使用Waters系统标配的ESCi多功能源建立一种同时检测NEIPA、NDIPA、NDMA、NMBA、NDEA 5种亚硝胺类基因毒性杂质的快速分析方法，分析时间6min。 如下图，ESCi电离源是沃特世串联四极杆系统标配的多功能电离源， 具有ESI独立工作模式、模拟APCI独立工作模式、及ESI和模拟APCI交替工作模式，因此称作“大气压电离复合源”。可实现一针进样 ,同时得到 ESI±和APCI±四张谱图；免工具安装,使用方便、维护简单。讨论ESCi多功能源是沃特世专属并标配的离子源，除了ESI独立工作模式外、它还有模拟APCI独立工作模式及ESI和APCI交替工作模式，用多功能源中的模拟APCI功能，用户无需另配APCI探针，只需插入一根电晕针即可实现，方便快捷。本方法基于UPLC-TQ-S micro系统，通过使用系统标配的ESCi多功能源建立了6 min内一针进样，实现 5 种亚硝胺类基因毒性杂质测定的方法。针对不同化合物在不同电离模式下灵敏度不同的特点，在一个方法中，实现 ESI与“APCI”电离模式的切换，取长补短，达成该5种亚硝胺化合物的同时分析，并确保不同化合物皆有较好的灵敏度。