牛奶中黄曲霉毒素检测方案(固相萃取仪)

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牛奶中的黄曲霉毒素M1的测定方法 黄曲霉毒素是一组化学结构类似的二呋喃香豆素的衍生化合物，可由曲霉菌黄曲霉、寄生曲霉等产生。黄曲霉毒素的主要形式包括 B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中黄曲霉毒素 M1（AFM1）是黄曲霉毒素B1在动物体内经过羟化生成 的代谢产物，主要存在于动物的乳、肾脏、肝脏、蛋、肉和尿中，其中以乳中最为常见。黄曲霉毒素M1是一 种强致癌性物质，毒性在黄曲霉毒素家族中仅次于黄曲霉毒素B2，急性毒性与黄曲霉毒素B2类似，能致癌、致畸、致诱变，%且对高温稳定，牛奶经巴氏杀菌后，黄曲霉毒素几乎不被破坏。 另外，当婴幼儿乳品及母乳中含有黄曲霉毒素M1时，对婴幼儿健康会造成影响，可以造成发育迟缓、肾功能降低、肝细胞癌早发甚至可能导致急性中毒死亡。近年来，世界各国纷纷制定了乳与乳制品中AFM1的限量标准。包括中国、美国和日本在内的许多国家规定奶及奶制品中AFM1的含量不得超过0.5μg/kg，其中，中国规定婴儿乳品及代乳品中AFM1不得检出。欧盟制定的标准更为严格，为0.05μg/kg。 目前AFM1的检测方法有酶联免疫吸附法、薄层色谱法、高效液相色谱法以及高效液相色谱-串联质谱法等。其中高效液相色谱-串联质谱法可对AFM1的检测进行准确的定性及定量分析，成为近年来真菌毒素检测的主要方向。本实验以免疫亲和柱净化牛奶样品，超高效液相色谱-串联质谱法检测牛奶中的AFM1，提供了一种高灵敏度和准确性的测定方法。 1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂 Xevo TQS液相色谱-串联质谱仪、固相萃取装置、AFM1免疫亲和柱。 AFM1标准品，乙腈、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾均为分析纯，实验用水位超纯水。磷酸盐缓冲液（PBS）配置：称取磷酸二氢钠0.27g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，加超纯水800ml充分搅拌溶解，然后 加入浓盐酸调PH至7.4，定容至1L。 1.2 方法 1.1.1 标准溶液配置 标准工作液：称取AFM1适量，乙腈定容配置成100ng/ml的工作液，4℃保存。 标准溶液：准确吸取100ng/ml标准工作液，用乙腈定容，配置成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ng/ml的标准系列浓度梯度，上机备用。 1.2.2 样品预处理 准确量取30ml牛奶样品，至50ml离心管中，水浴振荡使其温度加热至35-37℃，8000r/min离心10min。将50ml一次性注射器筒与AFM1免疫亲和柱顶部串联，再将亲和柱与固相萃取装置连接。取离心后的样液25ml过AFM1免疫亲和柱，流速2ml/min，稳定的慢速过柱能够使AFM1被免疫亲和柱的抗体所亲和。样品过柱后，用20mlPBS淋洗AFM1免疫亲和柱，过后抽干小柱。先后用1.5ml的乙腈和1.0ml的水洗脱免疫亲和柱，收集洗脱液。过0.22μm滤膜，待上机。 1.2.2.1 预处理所需仪器 HSE-08A数控固相萃取系统 HSE-12B固相萃取装置 HWT-20C恒温水浴摇床 1.2.3 仪器条件 色谱条件：C18液相色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；流速0.3ml/min；柱温40℃；进样量5μl；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇，梯度洗脱，洗脱条件见表1。 质谱条件：电喷雾离子源（ESI+）；质谱扫描方式为多反应检测（MRM）；电喷雾电压3.2KV；离子源温度150℃，雾化温度400℃，碰撞气为高纯氩气；碰撞气流速0.16ml/min。AFM1检测离子对、锥孔电压（cone）、碰撞能量（CE）见表2。 2 结果与分析 先后用1.5ml甲醇和1.0ml水作为洗脱剂对驻留在免疫亲和柱上的AFM1进行洗脱定容，洗脱后直接过膜上机。 2.1 线性范围和检出限 对配置好的标准品的梯度进行上样分析，以标准品浓度为横坐标，标准品色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，AFM1在0.1~10.0ng/ml的浓度范围内呈现出良好的线性关系，其线性方程和相关系数为y=14684.x-614.095(r=0.9978)。 在空白样品中添加标准工作液，通过计算得到本实验方法检出限（LOD,S/N>3）为0.001μg/kg，定量限（LOQ/N>10）为0.005μg/kg。 2.2 回收率和精密度 称取空白样品，对其进行标准品添加，选择0.05、0.2、1.0μg/kg三种不同浓度，上机检测进行数据处理，计算回收率和精密度，回收率在94.8%~98.2%之间，RSD在2.34%~3.87%范围内，结果见表3。 3 小结 本研究建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的超高效液相色谱-串联质谱的测定方法，本方法稳定性好，回收率高，检测线低，抗干扰能力强，适于测定牛奶中不同浓度的黄曲霉毒素M1，且能够在一定程度上降低检测成本，节省试验时间。