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结果和讨论2 并联色谱技术在生化蛋白样品及单克隆抗体分析中的应用 张婷婷刘绿叶金燕赛默飞(中国)有限公司 关键词:并联液相色谱;单克隆抗体;牛血清白蛋白;卵清蛋白;细胞色素C Key words: Parallel Chromatography, MAbs, BSA, Ovalbumin,Cytochrome C 引言 生物制药是生物技术产业中发展最为迅速的部分,以单克隆抗体药物为标志,目前全球已批准35个抗体药物上市,用于癌症、自身免疫、黄斑变性、血液病和感染治疗等。在生物制药的每个生产环节,产品的纯化和分析过程都至关重要。早期抗体的质量控制过程中,必须测定样品的效价、聚集体和电荷亚型。单克隆药物(MAb)产品中两个主要的杂质是电荷亚型单抗和单抗聚集体,这些副产物会产生与主产品不同的药效,有时会引起严重的副作用,如抗药性抗体的形成。蛋白聚体是在生产过程、纯化或者运输过程中产生(如温度,pH的影响)。本文讨论了采用一套HPLC系统(UltiMate3000钛系统)同时实现单克隆抗体的聚集体的分离和电荷亚型的分离。 测试条件 仪器:UltiMate 3000钛系统,包括带有在线脱气单元的双三元梯度泵;带有生物兼容的十通阀; WPS-3000T(B)FC分析型,带样品收集功能的自动进样器;紫外检测器(UV);二极管阵列检测器(DAD)。系统连接见图1。 离子交换色谱(IEC右泵) Thermo Scientific MAbPac SCX -10(4mm i.d.×250mm)色谱柱阳离子交换模式分离单克隆抗体的电荷亚型色谱条件: 流动相A: 20mM MES缓冲盐, 60Mm NaCl, pH5.6 流动相B:20mM MES缓冲盐, 300Mm NaCl,pH5.5 梯度分离条件:30min内15-45%B; 6min 100%B清洗;10min 15%B平衡 流速:1.0mL/min 检测波长:280nm 温度:30℃ 体积排阻色谱(SEC左泵) Thermo Scientific MAbPac SEC -1(4mmi.d.×300mm)色谱柱分离蛋白聚体色谱条件: With the same samples perform multiple separation stepsincluding SEC and IEC in a parallel configuration 图1并联色谱系统结构图 流动相:200mM 磷酸钠缓杉盐,250mMNaCI,pH6.8, 等度分离流速:0.25mL/min检测波长:280nm温度:30℃ 样品前处理 单克隆抗体样品由中科院生物物理研究所提供,浓度约为5mg/mL, 12000转/min离心10min, 取上清液过滤后分别用流动相稀释5倍,得到浓度为1mg/mL的溶液直接进样分析。 牛血清白蛋白(分子量66KDa, 等电点pl为4.7).卵清蛋白(分子量44KDa,等电点pl为4.7)和细胞色素C(分子量12KDa,等电点pl为10.7),购于Sigma公司。 取牛血清白蛋白样品适量,精密称定,加超纯水溶解,制成每2mg/mL的溶液。 取卵清蛋白样品适量,精密称定,加超纯水溶解,制成每2mg/mL的溶液。 取细胞色素C样品适量,精密称定,加超纯水溶解,制成每0.25mg/mL的溶液。 按照相同的方法配置三种蛋白的混合溶液。 重复性实验 取卵清蛋白(Oval)样品溶液, IEC分离模式下连续进样5次,每次进样20uL,最高峰峰面积RSD为0.34%,表明IEC方法重复性较好;取牛血清白蛋白(BSA)样品溶液, SEC分离模式下连续进样5次,每次进样20pL, 主峰峰面积RSD为0.55%,表明SEC方法重复性较好,两个方法之间互不干扰。 图2卵清蛋白(Oval) 在IEC分离模式下重复进样五次叠加色谱图 线性关系考察 按上述色谱条件,细胞色素C在0.02~2mg/mL范围内,SEC分离模式下,相关系数r为0.9997;卵清蛋白在0.05~2mg/mL范围内, IEC分离模式下,相关系数r为0.9999. 结论 在UltiMate 3000双三元钛系统色谱仪上,同时进行体积排阻色谱(SEC)和离子交换色谱(IEC)两种分离模式的并联液相色谱分离,共用一台自动进样器,两个分离模式相互独立,结果互不干扰(如图3)。 图3卵清蛋白(Oval)、牛血清白蛋白(BSA)和细胞色素C(CytC) 采用IEC分离模式的色谱图 在体积排阻色谱分离单克隆抗体时,根据MAb单体和多聚体分子量的差异能够将样品中二聚体与单体进行很好分离,结果见图4。同时在离子交换分离色谱条件下,根据MAb与其电荷亚型带电荷的差异进行分离,结果如图5所示,主峰为MAb色谱峰,而左右的杂峰则是其电荷亚型,能够得到较好分离。 在并联液相色谱分析过程中,自动进样器可顺序给两套系统分别进样,这个系统可配置不同的分离模式(IEC、SEC、RP和亲和色谱等),大大节约了时间和成本,是实验室提高效率的一个有效途径。因此该模型可以作为生物医药和蛋白分析的一个多功能色谱分析技术平台。 图4单克隆样品采用SEC分离模式的色谱图 图5单克隆样品采用IEC分离模式的色谱图 ( [1] Farnan D, Moreno D T, Stu l ts J, et a l. I nterlacedSize Exclusion Liquid Chromatography ofMonoclonal Antibodies. J Chromatography A2009, 1216(51):8904-8908 ) ( [2] Krisztia n H, Jacob F, Georges G. Optimizationstrategies for off-line two-dimensional liquidchromatography.J Chromatography A 2009, 1216: 2 511-2518 ) [3] Kathithileni M K, Andre Villiers. Off-linecomprehensive 2-dimensional hydrophilicinteraction x reversed phase liquidchromatography analysis of procyanidins. JChromatography A 2009, 1216:6274-6284 thermoscientific.com ( C 2012 T h e rmo Fishe r Scie n tific Inc . Al l ri g hts reserved. All trademarks are the pro p erty of Thermo Fisher Scientific Inc. a nd its s ubsidiaries. Specifications, terms a nd p r icin g are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your ) local sales representative for details. 上海 北京 免费服务热线:上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118邮编:201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118电话:021-68654588 邮编:100007传真:021-64457830 电话:010-84193588传真:010-88370548 ThermoFisherSCIENTIFIC oThermo Fisher Scientific,San Jose, CA USA is ISO Certified.SCIENTIFIC
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赛默飞色谱与质谱为您提供《单克隆抗体药物中生化蛋白样品及单克隆抗体分析中的应用检测方案(液相色谱仪)》,该方案主要用于治疗类生物药品中含量测定检测,参考标准《暂无》,《单克隆抗体药物中生化蛋白样品及单克隆抗体分析中的应用检测方案(液相色谱仪)》用到的仪器有null。
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