葡萄糖氧化酶中电化学性质检测方案(电化学工作站)

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光 谱 学 与 光 谱 分 析Spectroscopy and Spectral AnalysisVol.25，No.7，pp1151-1154July，2005第25卷，第7期2005年7月 第25卷光谱学与光谱分析1152 酶电极上葡萄糖氧化酶的活性的X射线微区分析 李 彤，姚子华 ，仇满德，安 伟，史大刚 河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002 摘 要 利用X射线微区分析，对二氧化硅溶胶-凝胶包埋于普鲁士蓝修饰玻碳电极上的葡萄糖氧化酶的活性进行了分析；以Ce(NO3)3为捕捉剂，底物葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用产生过氧化氢，后者与捕捉剂反应生成沉淀于酶的活性部位。从X射线微区分析结果表明：酶电极表面固定化酶的分布均匀，且保存较高的酶活，从微观的角度说明了酶电极的性能与酶电极表面酶活分布的关系。此法制备的葡萄糖氧化酶电极具有较高的灵敏度，稳定性，这与电化学测试结果是一致的。 主题词 X射线微区分析；葡萄糖氧化酶；酶电极；酶活 引 言 近年来，随着生物传感器的迅猛发展，作为生物传感器中研究的最多，应用最广的电化学生物传感器的研究更是引起人们极大的关注。我们研究制备安培型葡萄糖氧化酶传感器时，发现酶电极表面的性质如致密性、酶分布的均匀程度等对其性能有一定的影响。以往对修饰电极的表征手段多是对其表面形貌的分析12，3]，，也有报道对电极上酶的活性大小进行分光光度法宏观估测的[4]，但都不能说明表面酶的分布情况。如果能对酶电极上的酶活进行定位，清晰地确定电极上酶及酶活的分布，将有助于电极上酶的固定化方法研究以及酶电极性能的研究。 在我们以前的报道中，首次用 SEM EDS-IPP进行X射线能谱微区分析研究固定化酶酶活的定位15.71，其原理是基于组织和细胞化学中酶的化学定位，利用金属盐法进行固定化酶活性定位X射线微区分析的。 底物 酶 产物+捕捉剂(金属离子) 活性部位沉淀。 底物经固定化酶的酶活催化生成产物，捕捉剂与产物结合成难溶于水的沉淀，沉积在酶的活性部位上，利用聚焦电子束对固定化酶表面进行激发，有活性的部位发射出沉淀金属的特征X射线，利用X射线能谱分析即可定位活性部位。据我们所知，未见关于酶电极上酶活定位X射线分析报道。本研究将此法扩充到酶电极表面的酶活定位。对酶活进行X射线微分析，首先要求选择一个合适的捕捉剂，主要满足以下条件：①捕捉剂只与酶促反应产物起反应生成难溶于水的沉淀，而不与底物起反应；②要排除膜载体与底物、载体与 捕捉剂，电极上其他修饰物质、固定化酶与捕捉剂，捕捉剂与底物之间的干扰。我们已报道的固定化葡萄糖氧化酶活性X射线分析是利用铁离子作为捕捉剂，生成金属沉淀，聚焦电子束对固定化酶表面进行激发，有活性的部位发射出 Fe的特征X射线，利用X射线能谱分析即可定位酶的活性部位。由于我们研究使用的酶电极是利用普鲁士蓝修饰电极结合二氧化硅溶胶-凝胶膜固定葡萄糖氧化酶的，因此不能用铁盐作为捕捉剂。本工作研究了利用X射线微区分析对酶电极上凝胶膜中活性葡萄糖氧化酶定位的可能性和最佳定位条件的选择。利用铈盐作为捕捉剂，葡萄糖为底物，经葡萄糖氧化酶电极表面溶胶-凝胶膜固定的酶与其作用得到H202，与Ce(I)在弱碱性条件下生成过氧化氢氧化铺沉淀而沉积于活性部位，进行X射线微区分析，结果表明，此法可从微观的角度说明葡萄糖氧化酶电极上酶的活性及分布。并对使用过的电极表面酶活定位分析，从而说明该酶电极的高灵敏性和高稳定性，这与电化学研究的结果是一致的 实验部分 1.1 材料与仪器 KYKY1000B 扫描电镜(附Thermo NORAN Vantage 能谱仪)；Si(Li)探测器(Be窗厚7.6um；测量范围Na~U)；LK98BⅡ微机电化学分析系统，玻碳电极(GCE，中为3mm)(天津市兰力科化学电子高技术有限公司)；超级恒温器(上海市实验仪器厂)。 葡萄糖氧化酶(GOD， E. C. 1.1.3.4， 234， 900 units g、-1美国 Sigma公司；β-D(+)-葡萄糖(分析纯，北京瀛海精细化 ( 收稿日期：2004-03-01，修订日期：2004-07-06 ) ( 作者简介：李 丹，女，1963年生，河北大学化学与环境科学学院副教授，在读博士研究生 *通讯联系人 ) 工厂)；六水合硝酸(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；其余化学试剂均为分析纯。所用水均为二次重蒸水。 1.2 葡萄糖氧化酶电极及对照电极的制备 具有“三明治”结构的葡萄糖氧化酶电极(SiOz/GOD/PB/GCE)是由二氧化硅溶胶-凝胶包埋葡萄糖氧化酶于普鲁士蓝(PB)修饰玻碳电极上制得的，参见文献[1]。另外制备了作为对照的只有载体膜二氧化硅玻碳电极(SiOz/GCE)、普鲁士蓝修饰电极(PB/GCE) 和二氧化硅膜覆盖的普鲁士蓝修饰电极(SiOz/PB/GCE)。 1.3 孵育液的配制 孵育液①： 0.4 mL 5 mmol LCe (No)3 与4.6 mL 0.05mol LTris HC 缓冲液(pH7.2)， 0.1mL 0.5 molL葡萄糖溶液，4.9 mL水混合。 孵育液②(未加底物)：0.4 mL 5 mmol LCe(NO；)3与4.6mL 0.05 mol L Tris HCl 缓冲液 (pH 7.2)， 5 mL水混合。 孵育液在使用前过0.3 um滤膜，以除去在此pH值下可能生成的氢氧化铺微粒。 1.4 孵育方法 将 SiOz/GCE， PB/GCE ， SiOz/GOD/PB/GCE 分别插入孵育液②中，30℃，恒温孵育10 min，取取电极，放入0.05mol·L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)中，搅拌下洗涤10 min。如此洗涤两次。干燥器内干燥12h。分别编号为1，2，4号。 将 SiO2/PB/GCE， SiO2/GOD/PB/GCE 插入孵育液①中，其余操作同上。分别编号为3，5号。 1.5 X射线微区分析 将干燥的编号为1~5号的样品电极真空镀碳膜，然后安装在经改装的扫描电镜样品台上，在加速电压25 kV、工作距离24mm、放大200倍的工作条件下，对上述5个样品随机采集5次X射线能谱，每次采集时间为100s，得到对应谱图见图1~图5。利用X射线能谱仪的图像采集程序，分别对上述样品进行Ce，Fe 及 Si元素的X射线面分布采集，得到对应的元素面分布图。 2 结果与讨论 2.1 捕捉剂的选择 从图1可以看出，谱图上没有 Ce的特征峰出现，只有Si峰出现与SiO2/GCE(未经孵育)的谱图相似(图略)。从图2可以看出，谱图上没有Ce峰出现，而有Fe的峰，与 PB/GCE(未经孵育)的谱图相似(图略)。说明膜载体 SiO2，及作为媒介体的PB不与捕捉剂反应生成沉淀。由 SiO，膜覆盖的PB修饰电极在有捕捉剂、底物的孵育下得到的谱图(见图3)，只有Si和Fe的特征峰，没有Ce的特征峰，说明膜载体 SiOz 及PB不与底物相互作用，底物也不与捕捉剂作用。排除了载体、媒介体对底物和捕捉剂的干扰以及底物与捕捉剂作用的干扰。 Fig.1 Spectrum of SiOz/GCE surface incubated( without substrate) Fig. 2 Spectrum of PB/GCE surface incubated( without substrate) Fig.3 Spectrum of SiOz/PB/GCE surface incubated Fig.4 Spectrum of SiO2/GOD/PB/GCE surface incubated(without substrate) Fig.5 Spectrum of SiOz/GOD/PB/GCE surface incubated 图4与图5分别是葡萄糖氧化酶电极在捕捉剂存在下，在无底物和有底物的孵育下，得到的X射线谱图。图4中无Ce峰说明固定化的葡萄糖氧化酶不与捕捉剂发生作用，排除了捕捉剂对固定化葡萄糖氧化酶的干扰。而从图5可以看出，谱图上除有Si峰、Fe峰外，有明显的Ce峰，这是在消除了上述干扰的情况下，底物葡萄糖在酶电极表面固定的 GOD的酶活催化下氧化，产物之一—H02 被 Ce(NO3)3所捕捉形成沉淀，此沉淀沉积在固定化葡萄糖氧化酶酶活性的部位，所以谱图上出现了Ce的特征峰，因此可确定 Ce(Ⅲ)作为捕捉剂。由图3与图5对比也可看出，在有底物存在的情况下，没有葡萄糖氧化酶的存在，捕捉剂中的 Ce 元素也不会沉积到载体膜上，而只有在固定化葡萄糖氧化酶活性的部位，才会有Ce的沉淀。也证明了该方法的可行性。推断上述反应为： 这与文献[9]的描述是吻合的。 2.2 酶活定位条件的选择 酶活定位的孵育条件主要包括捕捉剂的量，底物浓度，孵育液的pH值，温度，时间等。 在实验中发现，孵育液中捕捉剂离子的浓度过大时，溶液中会有少量的淡黄色颗粒生成，它吸附在载体膜上可能造成干扰。而底物浓度过大，反而会降低此法的灵敏度。因此1.3节所示衫离子浓度，葡萄糖浓度为实验浓度。孵育 液的pH 值的确定是关键，由于 Ce与H0z的反应要在弱碱性条件下进行，而制备的酶电极的最佳适用pH值在6.5~7.5pH"，pH值再大，PB不稳定。因此选择 pH 7.2的 TrisHC缓冲液为实验所用。孵育温度的选择要在酶电极的使用范围内，既要保证酶促反应的速率，不致使孵育时间过长，又不致使酶失活。选择30℃恒温 10 min 为孵育条件。 2.3 酶电极表面葡萄糖氧化酶的定位分析 首先对SiOz/PB/GCE 的形貌进行分析(见图6)，看不出酶活的存在。从微观形态来确定固定化酶的位置和活性是不可行的。图7是5号样品的表面微区的Ce元素、Fe元素、Si元素X射线面分布图。图7(c)中的亮点密集的区域是Ce元素的分布区，显示了酶活存在的部位，结果看出，在酶电极上葡萄糖氧化酶的分布是均匀的。由于酶是被二氧化硅膜包埋固定的，Ce的分布与Si的分布有一定的对应关系，葡萄糖氧化酶是均匀分布在硅溶胶-凝胶膜内的。制备的酶电极经电化学测试后，其表面利用此法定位分析所得Ce元素的面分布图(见图8)表明，酶在电极上依然分布均匀，酶活没有流失。说明利用二氧化硅溶胶-凝胶技术固定酶于PB修饰电极上，这种“三明治”结构的固定，可以使固定的酶保持高的活性及均匀的分布，这是制备高灵敏、高稳定酶传感器的保证。 Fig. 6 Scanning electron microscopic photograph ofthe surface of enzyme electrode 0) Fig. 7 Mapping of Fe (a)， Si (b) and Ce(c) onthe enzyme electrode(128 X128) Fig.8 Mapping of Ce on the enzyme electrode(after being used) (128 ×128) 3 结 论 对于酶电极，利用X射线微区分析来定位酶活及分布情况的方法是可行的。选择 Ce(Ⅲ)离子作为捕捉剂，对制备的葡萄糖氧化酶电极上的葡萄糖氧化酶酶活进行X射线微区定位分析，从微观的角度说明了酶电极的性能与酶电极表面酶活及分布的关系，结果与电化学测试研究一致，证明制备的葡萄糖氧化酶电极具有较高的灵敏性及操作稳定性。此法有望应用于其他生物传感器乃至生物芯片上生物活性物质的微区分析研究。 ( 参 考 文 献 ) ( ] L I Tong， YAO Zi-hua (李 彤，姚子华). Chin e se Journal of Analytical Chemistry(分析化学)，2004，32(2)：237. ) ( I vanildo Luiz de Mattos， L ilia V Lukachova， Lo Go r ton， Thomas Laurell ， A r kady A Kary a kin. Talan t a， 2001， 54： 96 3 . ) ( Manoj K u R a m， Paolo Bertoncello， H D i ng， Sergio Paddeu， C l audio Nicolini. B iosensors & Bioelectronics . 200 1 ， 16：849. ) WU Xia-qin， CAO Da-wei，JIANG Hui-wen(吴霞琴，曹大为，蒋慧雯). J. of Shanghai Teachers University (Natural Sciences)(上海师范大学学报·自然科学版)，1994，23(2)： 159. [5] HUANG Yong zhang， YAO Z-hua， WANG Gui-hua， et al(黄永章，姚子华，王桂华，等).Chinese Iournal of Analytical Chemistry (分析化学)，2001，29(12)：1434. ( [6] DINGLiang， YAO Z-hua， LI T ong， QIU Man de ( 良，姚子华，李 彤，仇 满 德). Spe c troscopy and Spectral Analysis (光谱学与光谱分析)， 2003，23(2) ：4 00. ) [7] YAO Zi-hua， HUANG Yong-zhang， QIU Man-de(姚子华，黄永章，仇满德). Journal of Chinese Electron Microscopy Society(电子显微学报)，2001，20(1)：27. [8] Ogawa Kazuo editor(Japan)， Translated by ZHONG Ci-sheng(小川和郎(日)主编，钟慈声主译). Techniques of Enzyme Cytochemistry and Histochemis-try(酶组织和细胞化学技术)， Shanghai： Shanghai Medical University Press(上海：上海医科大学出版社)，1989. [9] Richard T Briggs， David B Drath， Manfred L Karnovsky， Morris J Karnovsky. The Journal of Cell Biology.1975， 67： 566. XRay Microanalysis of the Activity of Immobilized Glucose Oxidase onEnzyme Electrode LI Tong， YAO Z-hua，QIU Manr de， AN Wei， SHI Da gang College of Chemistry and Environmental Science， Hebei University， Baodingg071002，China Abstract The localization of activity of glucose oxidase (GOD) on the pussian blue modified electrode by SiO sol- gel was studied by X ray mi-croanalysis. Glucose and Ce (NO)3 served as substrate and capture respectively. Substrate was catalysed by immobilized GOD to produceH 02， and the H O2 was captured by Ce (NO)3 to form precipitate. The precipitation deposited the active site of immobilized GOD on the enz-yme electrode. The Xray microanalysis showed that the distribution of active enzyme on the surface of the enzyme electrode was uniform， andthe GOD immobilized maintained high activity. The Xray analysis exhibited that the properties of the enzyme electrode depended on the distribu-tion of enzyme activity on its surface from the view of microstructure ， and the developed GOD electrode was of high sensitivity and excellent sta-bility. The results agreed with the results of the electrochemical study. Keywords X ray microanalysis； Glucose oxidase； Enzyme electrode； Enzyme activity ( (Received March 1 ，2004； accepted July 6， 2004) ) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net