扩大线性的葡萄糖氧化酶电极中电化学性质检测方案(电化学工作站)

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河北师范大学学报/自然科学版/JOURNAL OF HEBEI NORMAL UNIVERSITY Natural Science Edition/Vol.31 No.4Jul.2007第31卷/第4期/2007年7月 .492 扩大线性的葡萄糖氧化酶电极 李 彤1，2 姚子华. 魏福祥 (1.河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄 050018；2.河北省污染防治生物技术重点实验室，河北石家庄 050018：3.河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002) 摘 要：利用控制酶的固定量和使用外层膜等手段，限制底物葡萄糖的扩散，制备了扩大响应线性范围的葡萄糖氧化酶电极.考察了酶电极上酶的不同固定量及外层膜组成比对线性响应的影响.结果显示：葡萄糖氧化酶的固定量 20 ug，外层膜组成比 V(TMOS) ：V(HO)：V(甲醇)=0.10.110.5时，制备的酶电极对葡萄糖响应的线性范围为8.0×10-5~1.2 ×10mol/L，线性范围扩大了2~3倍. 关键词：酶电极；葡萄糖；线性范围；外层膜； SiO2溶胶-凝胶 中图分类号：O 629.11 文献标识码：A 文章编号：1000-5854(2007)04-0491-04 血糖的含量是临床生化检验的重要的生理参量，正常人血糖为3.9~6.1mmol/L，因此，测定血糖含量是糖尿病临床诊断和治疗的重要依据.利用酶电极进行血糖测定的研究已有报道1~6]，但由于表观米氏常数小和被测溶液中含溶解氧的限制，限制了其线性范围，往往不能满足活体快速检测或高含糖食品等等量控制的需要，有必要研究扩大了线性范围又具高灵敏度的酶电极. 葡萄糖氧化酶电极，是双底物的酶电极，葡萄糖和氧共同作为酶促反应的底物参与反应. Leypoldt 等提出了双底物酶电极对葡萄糖检测的理论模型.通过理论分析和实验证明，得出双底物酶电极酶膜的催化活性、动力学常数、传质常数、限制性底物等对酶电极响应的影响.对于双底物酶电极，增大酶层的活性，表观米氏常数变小.敏感膜的催化活性越高，反应速率越快，同时，作为共底物的氧需要的量也越多，氧的缺乏问题凸现出来，成为影响反应速率的限制，进而影响到对底物的响应，因此在制备酶电极时，可采用控制酶膜上一定的酶固定量来增宽响应线性.酶电极对底物的响应动力学过程是由酶反应和扩散过程综合控制的，当酶附近的底物葡萄糖浓度成为限制性底物时，它的浓度和响应成线性，这时扩散过程为速率控制步骤.为了限制酶附近底物的浓度，通过外加一限制扩散的阻挡层来实现，当然阻挡层应限制底物葡萄糖的扩散，同时要保证氧的扩散，扩大线性响应范围[8，9].本文中，笔者通过采用控制酶动力学和限制扩散的方法，控制酶膜中酶的量，引入一外加溶胶-凝胶覆盖层等，制备了扩大线性范围的葡萄糖传感器. 1 实验部分 1.1 仪器与药品 LK98BⅡ微机电化学分析系统(天津兰兰力科化学电子高技术有限公司)，研究电极采用直径为3mm的玻碳平板电极，对电极为直径1mm、长5mm的铂柱电极，参比电极为Ag/AgCl(饱和KCI溶液)电极.实验中的电位值均是相对于 Ag/ AgCl(饱和 KCl溶液)电极.501型超级恒温器(上海实验仪器厂). 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase ，GOD，E. C1. 1.3. 4，Aspergillus niger ，100 U/ mg，AMRESCO.Inc.)；B-D(+)-萄萄糖(分析纯，北京瀛海精细化工厂)；四甲氧基硅烷(>98%，TMOS，武大有机硅新材料股份有限公司)；溴代十六烷基三甲胺(CTAB，北京化工厂)；其他试剂均为分析纯；所有溶液用二次蒸馏水配制. 葡萄糖标准溶液浓度为0.5mol/L，磷酸缓冲溶液含0.05 mol/L KHPO4/KHPO4和0.1 mol/L KCl. 1.2 酶电极的制备 1.2.1 PB莫修饰电极的制备 在修饰前，玻碳电极抛光后依次经稀NaOH、乙醇、稀HC及及二次水超声洗涤.PB膜修饰电极的制备见 ( *i 收稿日期：2006-02-28；修回日期：2006-04-13 ) ( 作者简介：李 彤(1963-)，女，河北张家口人，教授，博士，研究方向为化学修饰电极及生物传感器等. ) 文献[10]，制得的修饰电极在100℃下烘干1h，放置至室温，留做制备酶电极用. 1.2.2 Sio2溶胶-凝胶溶液的制备 SiO2 溶胶-凝胶(sol-gel)溶液是由前驱体 TMOS的甲醇溶液在稀 NaOH催化下水解得到，用于成膜.配制不同组成的溶胶-凝胶溶液(见表1).其中分别加入5 mmol/L NaOH 0. 02 mL ，38.5 mL/L CTAB 0.02mL.CTAB甲醇溶液的加入是为了防止溶胶-凝胶成膜时收缩引起的脆裂，并使其形成微孔均匀的膜.溶液使用时现配. 1.2.3 酶电极的制备 参考文献[3]制备葡萄糖氧化酶电极，在5支制备好的PB修饰玻碳电极上先分别滴加 GOD 溶液，晾干后，取新鲜配置的 SiO2 sol-gel 溶液滴于其上，溶剂挥干，形成均匀的酶膜附着于及极上，制得酶电极.其中1支酶电极编号为5#.再分别取按1.2.2项配制的不同组成的 SiO2 sol-gel溶液滴于其他4支酶电极上，形成外层膜，制得不同外层附加膜的葡萄糖氧化酶电极，编号分别为1#~4#(见表2).另按5#酶电极的制备方法制备了不同酶固定量的酶电极. 表1 SiO2溶胶-凝胶溶液的组成 mL 表2 制备不同外层膜酶电极的结构和组成 编号 TMOS 甲醇 HO 酶电极 基质电极 酶 层 外层附加膜 SiO2 sol-gel① 0.1 1.0 0.3 PB/ GC 20 ug GOD+SiO2 sol- gel ① SiO2 sol- gel ① SiO2 sol- gel ② 0.1 1.0 0.2 2# 3# PB/ GC PB/ GC 20 ug GOD+SiO2 sol-gel ① 20 ug GOD+ SiO2 sol-gel ① SiO2 sol- gel ② SiO2 sol-gel ③ SiO2 sol-gel ③ 0.1 1.0 0.1 4# PB/ GC 20 pg GOD+SiO2 sol-gel ① SiO2 sol-gel ④ SiO sol- gel ④ 0.1 0.5 0.1 5# PB/ GC 20pg GOD+ SiO2 sol-gel ① — 1.3 安培检测 将制备的工作电极及 Ag/AgCl参比电极、铂对电极置于含10 mL 磷酸盐缓冲溶液的电解池中，采用三电极体系，用磁力搅拌器搅拌，在恒温、恒电位下，待背景电流稳定后注入被分析底物溶液，记录其安培响应. 2 结果与讨论 2.1 氧作为共底物对酶电极的影响 考察了5”酶电极在空气饱和的溶液中和纯氮气饱和的溶液中对葡萄糖的响应及线性范围(见图1).在氮气饱和时，酶电极的响应与空气饱和情况比较小得多，且很快达到饱和，线性范围也小得多，说明氧作为共底物，它的量确实影响着酶电极的响应性能.特别是在高浓度葡萄糖时，氧的缺乏成为酶反应的动力学控制步骤. a.空气饱和的溶液中；b.N2饱和的溶液中. 图1 葡萄糖传感器响应曲线(插图为电流-时间曲线) 2.2 酶膜中 GOD 固定量对线性范围的影响 电极上酶的固定量对传感器的灵敏度及线性范围有一定的影响.考察了与5”酶电极具有相同结构、酶的量分别为10，20，30，60 ug 的电极的葡萄糖响应，实验结果见图2.从图2可以看出，固定的酶量大的酶电极的响应随葡萄糖浓度改变的变化率大于固定 GOD 小的电极；而且使用 GOD固定量大的酶电极，得到的线性范围较小，使用 GOD 固定量小的酶电极，得到的线性范围较宽，但灵敏度减小.这是由于氧化酶型的传感器需要氧作为共底物来进行氧化反应，氧的浓度或分压势必影响传感器的响应.随着底物葡萄糖浓度的增大，氧的缺乏使氧成为反应的速度限制物质7.随着酶的固定量的增大，在酶电极上相同底物浓度存在下酶促反应的速度加快，耗氧较多，氧的缺乏很快出现，使得达到最大反应速度的饱和底物浓度变小，造成线性范围缩小.由此可见，通过酶反应动力学的控制，可以改变响应的线性范围. 2.3 酶膜厚度对响应的影响 实验中发现，酶电极的固定酶膜的厚度对酶电极的响应、线性范围及响应时间都有一定的影响.实验中 通过甲醇的用量不同而保持其他用量不变，来控制硅胶膜的厚度.膜的厚度增加，灵敏度减小，线性范围有所增宽，响应时间相应变长.太薄的膜有可能造成酶电极的稳定性差. 2.4 外层膜的使用对酶电极线性范围的影响 酶电极的外层膜，可通过溶胶-凝胶组成中TMOS与HO的用量比来控制其孔径，以溶剂不同的使用量来控制其厚度.由1#~4#酶电极的响应情况(见图3)看出，酶电极使用附加外层膜与没有外层膜比较，线性范围有显著的增大.外层膜的 TMOS、甲醇用量相同，HO的用量依次减小制备的酶电极，对葡萄糖的响应也随之递减，而线性范围是递增的.说明随外层膜孔径的变小，底物向酶层扩散的限制增强，同时保证作为共底物的氧相对自由地扩散，使得响应的线性范围扩大了.4与3"酶电极相比，外层膜只减少了甲醇的用量，其线性范围又有进一步的扩大.这是因为，甲醇用量的减小意味着膜的厚度的增加，这又增加了膜的阻挡作用.通过水的用量控制成膜的孔径大小来限制底物的扩散，使得实际扩散到达酶层的底物浓度减小，扩散成为速度控制步骤，而扩大了响应的浓度范围.外层膜的厚度对限制底物扩散也有影响，较厚的膜，限制了扩散，有利于线性上限的提高，但有可能使响应时间延长.无论是通过膜孔径大小，还是由膜的厚度来控制底物的扩散，扩大响应的线性范围都是以损失一定的灵敏度为代价的. a. 10 ug； b.20ug； c. 30 ug；d. 60pg. 图2 酶的固定量对酶电极响应的影响 图3 不同组成比的溶胶-凝胶外层膜对酶电极响应的影响 由以上实验结果分析，酶电极上酶的固定量、控制外层膜微孔大小的TMOS与水的用量比、膜的厚度都影响着响应的线性范围.酶的固定量小，线性范围宽，但含量小酶电极的稳定性差，寿命短；而膜的通透性较差也可延长线性范围，但响应时间也相应地延长，灵敏度下降，因此，在制备酶电极时，要根据实际检测需要，综合考虑选择适当的制备工艺，制备出具有一定响应特性的酶电极.笔者选择酶量为20ug，外层膜组成为V(TMOS) ：V(H2O)：V(甲醇)=0.110.10.5时制备酶电极. 2.5 酶电极的操作条件及响应性能 分别使用1#~4#酶电极在-0.05V，25℃，pH6.5的磷酸缓冲液中，对连续加入一定量的葡萄糖溶液，记录电流-时间曲线，得到对葡萄糖的回归方程.见表3. 表3 制备的应用外层膜的葡萄糖氧化酶电极的安培响应性能 酶电极 线性范围/ 线性回归方程 检出限/ 响应时间/ RSD/% (molL-) I/uA.C/(mmol L) (molL-) S (n=8) 1# 8.0×10-5~6.0×103 I=-0.1219+0.5855C 8.0×10 10 2.4 2# 6.0×10-5~7.5×10 I=-0.06571+0.4885C 6.0×10 12 5.2 3# 1.0×10~4~9.0×10 I=-0.03692+0.3606C 1.0×104 12 3.1 4# 8.0×10-5~1.2×10-2 I=0.002770+0.1800C 8.0×10’ 14 3.8 注：*为电极对1 mol/L 葡萄糖溶液重复8次测定得到的. 从数据看出，4”酶电极的线性范围最大，达到12.0mmol/L.据目前文献报道，基于PB的葡萄糖生物传感器的特点都是灵敏度大，而线性范围小，其中 Zhu等1制备的酶电极线性范围是0~6.0 mmol/L 葡萄糖.笔者改进的葡萄糖氧化酶电极具有更大的线性范围.对4*电极的稳定性考察，每天对相同的葡萄糖溶液测 定2次，30d后其电流响应达到原来的90% 3 结 论 控制酶的固定量，使用一附加外层微孔溶胶-凝胶膜以增强底物扩散的阻力而制备的葡萄糖氧化酶电极，扩大了其对葡萄糖响应的线性范围.酶的固定量为20ug，外层膜制备时，V(TMOS)：V(HO) ：V(甲醇)为0.110.110.5的线性范围为8.0×10-5~1.2 ×10mol/L，是未使用外层膜时的2~3倍，同时还保持较大的灵敏度和稳定性；又由于它的高选择性，使得其有更大的应用前景. 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Effects on the linearityof enzyme electrode prepared have been studied by changing enzyme loading and constitute of the outer layer.The results show the approach has given linearity up to 12.0 mmol/L glucose with the enzyme loading of 20 ugand V(TMOS) ：V(H2O) ：V (methanol) is 0.1 10.1 10.5 in the outer membrane prepared ，while extending 2 to3 times as wide as linear range of the enzyme electrode without the outer membrane. Key words ：enzyme electrode； glucose； linear range； outer membrane； SiO2 sol-gel ( (责任编辑 邱 丽) ) China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net