细胞培养上清液中糖类化合物检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA14-390Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-267 咨询电话：021-22013542http：//www.shimadzu.com.cn上海市淮海西路570号红坊E楼 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法同时测定细胞培养上清液中95种化合物 LCMSMS-267 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060联用，建立了 一种同时测定细胞培养上清液中95种化合物的方法。该方法在 17 min 内可完成95种化合物的分析，适用于细胞培养上清液中糖类、氨基酸类、核苷酸类、维生素类等化合物的快速检测，且重复性好、灵敏度高。利用该方法，我们考察了细胞株在4种不同培养基中的营养物和代谢物变化情况，并绘制出目标物的时间变化趋势图，对相关研究人员判断细胞状态、改进培养基组成具有一定参考意义。 关键词：超高效液相色谱仪(三重四极杆质谱仪细胞培养上清液代谢物分析 细胞培养基是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，为促进细胞生长增殖提供物质基础，是培养细胞生长和繁殖的生存环境。合成细胞培养基是用化学成分明确的试剂配制的培养基，是目前常用的一类培养基，其组分稳定，主要包括糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类等。 培养基组分的变化，对细胞生长会产生一定影响，如细胞生长形态、分裂速度等。同时，适宜的培养基组成与优选的细胞培养工艺对于提高蛋白类药物的产率，保证细胞培养批次之间的一致性、稳定关键质量属性等因素至关重要。因此，寻求一类合适的培养基组成，对细胞培养具有重大意义。 细胞生长状态的分析，除形态学观察外，还可对细胞培养上清液中细胞代谢物进行分析，通过考察细胞上清液中营养物和代谢物的变化，判断细胞在生长增殖过程中状态的优劣。鉴于此，我们开发了“细胞培养分析方法包”，该技术可在17分钟内同时分析95种细胞培养上清液营养成份和代谢物的相对丰度变化。 本文使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱LCMS-8060联用，结合“细胞培养分析方法包”建立了细胞培养上清液中营养物质和细胞代谢物的液相色谱-串联质谱的同时分析方法，为相关研究人员评估细胞生长状态、改进培养基组分提供参考。 1.1仪器 本实验使用岛津液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用系统。具体配置为LC-30ADx2(输液泵)， DGU-20A5R(在线脱气机)， SIL-30ACMP(自动进样器)， CTO-30A(柱温箱)， CBM-20A系统控制器， LCMS-8060 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver.5.82色谱工作站。 1.2分析条件 1.2.1仪器条件 液相色谱条件 分析仪器： LC-30A系统 色谱柱：见“细胞培养基上清液分析方法包” 流动相：见“细胞培养基上清液分析方法包” 流 速：0.35mL/min 进样体积：： 1uL 柱 温：40℃ 洗脱方式：见“细胞培养基上清液分析方法包” 质谱条件 分析仪器： LCMS-8060脱溶剂管温度：250℃离子源：IESI(+/-)加热模块温度：400℃雾化气：氮气3.0 L/min扫描模式：多反应监测(MRM)加热气：氮气10.0L/min离子源接口电压： +4.5kV；-3.5kV干燥气：氮气10.0L/min监控的化合物信息：：见表1 碰撞气：氩气 MRM参数：见“细胞培养基上清液分析方法包” 接口温度：300℃ 1.2细胞培养和取样方法 (1)细胞株： CHO DG44 细胞朱 (2)细胞培养方法：取对数期细胞，传代并接种于培养瓶中。实验中使用4种不同培养基，分别为无蛋白培养基I：proCHO5、无动物源成分培养基I： Balan CD Growth A、无蛋白培养基Ⅲ： opti CHO 和无蛋白无动物源成分培养基IV： Forti CHO。每种培养基分别制备8管，每管各取 5mL 培养基培养一瓶细胞，连续培养5天。 (3)取样方法：每个时间点(5min，3h，10h， 1d， 2d，3d，4d，5d)分别从每组相应的细胞中取500pL细胞培养基上清液(取样3次)，以Ⅰ为例：5 min时从I-1中取500 pL； 3h时从I-2取500uL，依此类推，直至 Day5； I-0为培养基原液。 1.3样品制备 取500uL细胞培养液，在室温下离心1 min (3000rpm)， 吸取100uL离心后上清液到新的离心管中。然后加入20 uL 2-异丙基苹果酸内标溶液(0.5mmol/L)， 再加入200uL乙腈，涡旋使充分混匀，室温下离心15 min (15000 rpm)。精密吸取上清液100 pL，加入900pL水，涡旋混匀，上机前再用纯水稀释50倍。 结果讨论 2.1细胞培养上清液分析色谱图 使用“细胞培养分析方法包”中的方法对CHO DG44细胞培养上清液中的组分进行分析，目标组分不同程度被检出，色谱图如如1所示。 LCMSMS-267 图2细胞培养上清液目标组份含量变化趋势图 2.2目标物含量变化趋势图 取各组细胞培养上清液在不同时间点的样品进行测定，以2-异丙基苹果酸为内标，得到各目标组份的面积比。以面积比为纵坐标，时间点为横坐标绘制折线，得到不同时间点时目标营养物和代谢物组份含量的变化趋势图，如图2所示。 在4种培养条件下，己糖、天冬酰胺、谷氨酰胺和胆碱随时间的变化，均呈现下降趋势，而丙氨酸、苹果酸呈现上升趋势。对于乳酸而言，在Ⅰ和Ⅱ型培养基中，乳酸浓度为先升高后平稳的趋势，而I和ⅣV型培养基中，乳酸浓度变化为先升后降。不同细胞上清液中，Ⅰ型培养基中的甘氨酸含量明显高于其它培养基，而谷氨酰胺、维生素 B12明显低于其它培养基；ⅢI型培养基中的半胱氨酸含量明显高于其它培养基；IV型培养基中的谷氨酸、叶酸含量明显高于其它培养基。生物素在各培养基中的含量为： II>IV>III>I。 结论 本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪LCMS-8060 联用，并结合细胞培养基上清液分析方法包，完成了在4种不同培养基条件下，细胞上清液中营养物和代谢物变化情况，并绘制出目标物的时间变化趋势图。该结果有助于相关研究人员判断不同条件下细胞的生长状态，为培养基配方优化提供指导意义。 田岛津全球应用技术开发支持中心 表1.细胞培养方法包中96种化合物列表 编号 化合物名 类别 编号 化合物名 类别 编号 化合物名 类别 1 2-Isopropylmalic acid 内标 33 N-Acetylaspartic acid 氨基酸 65 Cytidine 核苷酸 2 Gluconic acid 糖类 34 N-Acetylcysteine 氨基酸 66 Cytidine monophosphate 核苷酸 3 Glucosamine Carbohydrate 糖类 35 Ornithine 氨基酸 67 Deoxycytidine 核苷酸 4 Hexose (Glucose) Carbohydrate 糖类 36 Oxidized glutathione 氨基酸 68 Guanine 核苷酸 5 Sucrose Carbohydrate 糖类 37 Phenylalanine 氨基酸 69 Guanosine 核苷酸 6 Threonic acid Carbohydrate 糖类 38 Pipecolic acid 氨基酸 70 Guanosine monophosphate 核苷酸 7 2-Aminoadipic acid 氨基酸 39 Proline 氨基酸 71 Hypoxanthine 核苷酸 8 4-Aminobutyric acid 氨基酸 40 Serine 氨基酸 72 Inosine 核苷酸 9 4-Hydroxyproline 氨基酸 41 Threonine 氨基酸 73 Thymidine 核苷酸 10 5-Glutamylcysteine 氨基酸 42 Tryptophan 氨基酸 74 Thymine 核苷酸 11 5-Oxoproline 氨基酸 43 Tyrosine 氨基酸 75 Uracil 核苷酸 12 Alanine 氨基酸 44 Valine 氨基酸 76 Uric acid 核苷酸 13 Alanyl-glutamine 氨基酸 45 4-Aminobenzoic acid 维生素 77 Uridine 核苷酸 14 Arginine 氨基酸 46 Ascorbic acid 维生素 78 Xanthine 核苷酸 15 Asparagine 氨基酸 47 Ascorbic acid 2-phosphate 维生素 79 Xanthosine 核苷酸 16 Aspartic acid 氨基酸 48 Biotin 维生素 80 Penicillin G 抗生素 17 Citrulline 氨基酸 49 Choline 维生素 81 2-Aminoethanol 其他 18 Cystathionine 氨基酸 50 Cyanocobalamin 维生素 82 2-Ketoisovaleric acid 其他 19 Cysteine 氨基酸 51 Ergocalciferol 维生素 83 3-Methyl-2-oxovaleric acid 其他 20 Cystine 氨基酸 52 Folic acid 维生素 84 4-Hydroxyphenyllactic acid 其他 21 Glutamic acid 氨基酸 53 Folinic acid 维生素 85 Citric acid 其他 22 Glutamine 氨基酸 54 Lipoic acid 维生素 86 Ethylenediamine 其他 23 Glutathione 氨基酸 55 Niacinamide 维生素 87 Fumaric acid 其他 24 Glycine 氨基酸 56 Nicotinic acid 维生素 88 Glyceric acid 其他 25 Glycyl-glutamine 氨基酸 57 Pantothenic acid 维生素 89 Histamine 其他 26 Histidine 氨基酸 58 Pyridoxal 维生素 90 Isocitric acid 其他 27 Isoleucine 氨基酸 59 Pyridoxine 维生素 91 Lactic acid 其他 28 Kynurenine 氨基酸 60 使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用，建立了一种同时测定细胞培养上清液中95种化合物的方法。该方法在17 min内可完成95种化合物的分析，适用于细胞培养上清液中糖类、氨基酸类、核苷酸类、维生素类等化合物的快速检测，且重复性好、灵敏度高。方案利用该方法考察了细胞株在4种不同培养基中的营养物和代谢物变化情况，并绘制出目标物的时间变化趋势图，对相关研究人员判断细胞状态、改进培养基组成具有一定参考意义。