内源性细胞中中心碳代谢物检测方案(液质联用仪)

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安捷伦代谢组学动态 MRM数据库和方法 技术概述 作者 前言 Mark Sartain 安捷伦科技公司 ( 美国加利福尼亚州圣克拉拉市 ) 由于内源性细胞代谢物的理化性质差异巨大，因此代谢组学研究的一项主要挑战就是如何通过单一LC/MS分析方法对内源性细胞代谢物进行稳定、可重现的色谱分离。一种更易于控制的色谱解决方案是针对一小组代谢物开发通路靶标的分析方法。建立优化的靶向 LC/MS/MS 方法是一项艰巨的任务，需要花费大量的时间和资金来表征大量化学标准品。 安捷伦开发出了一套适用于215种以上中心碳代谢物的 LC/MS/MS 解决方案，可以稳定、可重现地分离酸性代谢物。该解决方案包括收录了保留时间和最佳 MS/MS 采集参数的优化数据库，还包括数据采集和分析方法。代谢组学 dMRM 数据库和方法利用了 Agilent 6470 三重四极杆 LC/MS 系统的高灵敏度和宽动态范围，以及安捷伦喷射流离子源久经考验的电离增强功能[1]。 本应用简报介绍安捷伦代谢组学dMRM 数据库和方法的优势，其针对中心碳代谢物提供一套已经过优化且简单直接的靶向分析方法，让研究人员能够轻松执行分析。 Agilent Technologies 解决方案概述 目前已有许多色谱方法被应用于代谢组学分析，包括反相色谱、正相色谱和 HILIC，但由于对极性代谢物的选择性、重现性或保留特性较差，这些色谱方法通常都不理想。为解决这些挑战，我们开发出了一种高度重现且稳定的离子对反相 (IP-RP) 色谱方法用于分离阴离子型和疏水性代谢物。该色谱方法利用稳定的 Agilent ZORBAXExtend C18 色谱柱和离子对剂剂三丁胺 (TBA)。在离子对色谱中通常使用非挥发性季铵，但季铵会干扰电喷雾电离。 TBA 是一种适用于电喷雾电离的挥发性三元胺，其可以用作离子对试剂，有利于实现酸性代谢物可重现的保留。存在 TBA时，非酸性代谢物仍保持原有的反相选择性。本文介绍的离子对 LC/MS 方法可同时分析多种功能类别的代谢物，包括氨基酸、柠檬酸循环中间体及其他羧酸、核碱基、核苷、糖磷酸和脂肪酸。 将 Agilent 1290 Infinity 系列 UHPLC 与 Agilent 6470 三重四极杆LC/MS联用，组成一套高灵敏度、高选择性的系统用于检测靶向代谢物(图1)。为了获得高灵敏度和高选择性，在多反应监测(MRM)模式下运行三重四极杆系统。MRM模式为每种化合物指定了预定的母离子-碰撞诱导子离子对，术语称为“离子对”。分析复杂样品时，应尽可能添加第二对离子对，以提高化合物鉴定的可靠性。通过获取离子对的色谱保留时间，可以对化合物鉴定结果进行正交确认。 采用单一LC/MS分析方法分析多种化合物时，由于同一时间需要分析的 MRM 离子对数量增加，会缩短测定(驻留)时间并影响检测限(LOD)。利用各种化合物的保留时间信息，可在整个 LC/MS运行过程中使用预期保留时间附近的窗口动态创建MRM 离子对列表。通过这种方式，可以只在化合物从LC中洗脱时对其进行监测， 从而改善了 LOD 并能够测定更多的代谢物。在 AgilentMassHunter 采集软件中，使用保留时间窗口的模式称为动态 MRM (dMRM) 模式[2]。该解决方案使用 dMRM方法以最大限度降低中心碳代谢物的 LOD。 此分析方法适用于基质组分可能影响方法性能的复杂样品。该解决方案的 LC/MS 配置中包括保护柱和切换阀配置，切换阀可在每次分析运行之后对色谱柱和保护柱进行反冲。这能非常有效地清除保护柱中的潜在基质污染物，从而提供一致的优异峰形和卓越的保留时间长期稳定性。 方法 IP-RP色谱可有效分离阴离子型和疏水性代谢物。该方法使用由溶剂 A (含10mM三丁胺的97：3水/甲醇+15mM乙酸)和溶剂B(含10mM三丁胺的甲醇+15mM乙酸)形成的梯度。选择Agilent ZORBAX Extend C18色谱柱，因为它在本方法所用的 pH条件下非常稳定。有关色谱和溶剂前处理的详细信息，请参阅《代谢组学动态 MRM方法设置指南》 (G6412-90002)。 安捷伦先进的三重四极杆自动调谐程序可优化所有不依赖于化合物的仪器设置。由于代谢物的理化性质各不相同，因此必须针对各个化合物优化具体质谱参数以实现最佳性能。对于安捷伦系统，这些参数包括碎裂电压(优化进入质谱仪的母离子的传输效率)和碰撞能 量(让特定的子离子获得最大强度)。安捷伦代谢组学dMRM 数据库针对所有代谢物提供经过优化的参数。该数据库中的主要离子对、保留时间、碰撞能量和碎裂电压这些参数由安捷伦与多伦多大学 Adam Rosebrock 博士的实验室合作开发，该团队是代谢组学领域的领先研究团队。这些优化的参数是广泛分析化学标准品的结果，能够生成最优质的结果。 该数据库可链接至 MassHunter 采集软件和 MassHunterOptimizer [3]。如果需要， MassHunter Optimizer 还可用于将其他代谢物添加到数据库中。用户可根据其特定需求从数据库中选择化合物以快速创建自定义分析方法。图2展示了用于控制 Agilent 6400系列三重四极杆LC/MS系统的 MS QQQ 采集设置选项卡。该数据库中包括化合物名称、CAS号等代谢物信息，还包括各离子对的优化采集参数。此外，其中还包括用于动态 MRM模式的保留时间和保留时间窗口，此参数在用户采用与数据库中相同的硬件配置和液相色谱方法时有效。使用安捷伦“数据库浏览器”(图3)，用户可选择化合物及其优化的采集参数并将其导入采集方法中。 图2. Agilent MassHunter 采集 QQQ 选项卡，展示了“从数据库导入”的功能 图3.3.：代谢组学 dMRM 数据库的“数据库浏览器”视图 本文介绍的 LC/MS分析方法的关键在于数据库中的化合物保留时间。在将 MRM 信号分配给复杂基质中的代谢物时，保留时间有助于提高正确分配的可靠性，并且能实现动态 MRM 采集。IP-RP方法的保留时间一致性极佳，因此可应用较窄的保留时间窗口，从而以更出色的 LOD分析更多代谢物。 数据库提供默认的采集方法(.m)文件，可以无缝实施针对所有代谢物的完整动态 MRM 方法。方法文件提供所有必需的仪器参数，其中许多参数对于重现数据库中给定的保留时间至关重要。分析方法中提供的安捷伦喷射流离子源设置经过了优化，能够有效电离各种代谢物。所选分析周期能够最大程度提高灵敏度并确保获得足够的数据点，以实现可重现的色谱峰积分。图4为采用默认采集方法采集的代谢物混标的叠加 MRM色谱图。 图4.4.上样量为5ng 的100多种代射物标准品的叠加 MRM色谱图 数据分析工作流程 代谢组学动态 MRM (dMRM) 数据库和方法包括用于处理LC/MS 数据的 MassHunter定量分析方法。对于涉及多种分析物的大规模分析批次， MassHunter 定量分析软件提供有助于批量查看数据的有用功能，例如“化合物数据概览”(图5)、动态链接结果和无参数设定的积分算法。 本文介绍的分析方法被设计为能够进行相对比较研究的方法。如果用户添加了代谢物校准曲线，则数据分析方法可以执行定量分析。此外，用户可对方法、数据库和工作流程进行扩展，通过添加加标对照样品以及同位素标记内标的离子对实现更出色的定量分析。 安捷伦完整代谢组学工作流程支持代谢组学动态 MRM数据库和方法生成的结果。为此， MassHunter 定量分析软件将自动生成报告(图6)，用于导入安捷伦多变量分析软件 Mass Profiler Professional [4]。导入的结果包括代谢物名称、积分峰丰度和化学标识符(CAS)，可用于多变量样品比较及随后的通路分析。差异结果可由Mass Profiler Professional 的 Pathway Architect 模块进行分析，从而识别出受影响的通路，以便进行生物学解析(图7)。 Pathway Architect 支持三种主要的通路内容来源： WikiPathways、BioCyc/MetaCyc 和 KEGG [5]。为加深生物学理解，用户可以在 Pathway Architect 中将靶向代谢组学结果与其他组学数据(蛋白质组学、转录组学)相结合进行多组学分析。 ( 图5.， Agilent MassHunter 定量分析软件中的“化合物概览”视图，显示了三个样品( 行 )中的五种化合物(列) ) B C 图6.生成 Agilent MassHunter 定量分析报告并导入 Agilent Mass Profiler Professional 中。根据大规模样品批次的结果可轻松生成报告(A)， 然后在选定数据源类型(B)并指定定量报告文件的位置 (C)之后将结果导入Mass Profiler Professional 中 CITRATE CYCLE (TCA CYCLE) 图7. Agilent Mass Profiler Professional 的 Pathway Architect模块，给出了来自KEGG 的酵母 TCA 通路。其中重点显示了与实验数据匹配的代谢物。数据在通路中以可视化形式示出，通过热条带指示了样品组之间的归一化相对丰度，在本例中为乙酸盐或葡萄糖培养基上的酵母生长情况 ( 安捷伦代谢组学动态 MRM (dMRM)数据库和方法专为复杂生物基质中中心碳代谢物的靶向 LC/MS分析而开发。 本文采用 Agilent 1290 Infinity II UHPLC 与 Agilent 6470三重 四极杆质谱仪联用的系统，对该 LC/MS方法进行了优 化。这一 UHPLC-MS/MS 方法与采集数据库的组合可提 供：针对棘手酸性代谢物分析的稳定的最优离子对反相-色谱方法，包括代谢物特定的 LC/MS/MS 离子对和保留时间的优化数据库；以及受安捷伦完整代谢组学工作流程支持的默认数据分析方法。代谢组学动态 MRM(dMRM)数据库和方法可实现快速设置并获取优异结果， 无需进行分析方法开发。 ) ( 参考文献 ) ( 1. S. Buckenmaier， et al.“Instrument Contributions to Resolution and Sensitivity In Ultra High PerformanceLiquid Chromatography U s ing Small B o re C o lumns：Comparison Of Diode Array a n d Triple Q uadrupole MassSpectrometry Detection"J. C h romatogr. A 1377， 64-74， (2015) ) 2. P. Stone， et al. New Dynamic MRM Mode ImprovesData Quality and Triple Quad Quantification in ComplexAnalyses((利用新型动态多反应监测模式改善复杂分析的数据质量和三重四极杆的定量结果)。安捷伦科技公司技术概述，出版号5990-3595 (2009) ( 3. MassHunter Optimizer Software for Automated MRMMethod Development Using the Agilent 6400 Series Tripl e Quadrupole Mass Spectrometer s (使用 MassHunter Optimizer 软件进行 Agilent 6400 系列三 重四杆质谱仪的自动化 MRM 方法开发)。安捷伦 科技公司技术概述，出版号 5 990-5011(2010) ) 4. Agilent Mass Profiler Professional Software： Discoverthe Difference in your Data (安捷伦 Mass ProfilerProfessional 软件：发现数据中的差异)。安捷伦科技公司产品样本，出版号5990-4164 (2014) 5. Agilent Pathway Architect： From Discovery to Insight(Agilent Pathway Architect：从发现到探究)。安捷伦科技公司产品样本，出版号5991-1459 (2014) 更多信息 这些数据仅代表典型的结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站 www.agilent.com。 www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2016 2016年3月10日， 中国出版 5991-6482CHCN Agilent Technologies 前言由于内源性细胞代谢物的理化性质差异巨大，因此代谢组学研究的一项主要挑战就是如何通过单一LC/MS 分析方法对内源性细胞代谢物进行稳定、可重现的色谱分离。一种更易于控制的色谱解决方案是针对一小组代谢物开发通路靶标的分析方法。建立优化的靶向LC/MS/MS 方法是一项艰巨的任务，需要花费大量的时间和资金来表征大量化学标准品。安捷伦开发出了一套适用于215 种以上中心碳代谢物的LC/MS/MS 解决方案，可以稳定、可重现地分离酸性代谢物。该解决方案包括收录了保留时间和最佳MS/MS 采集参数的优化数据库，还包括数据采集和分析方法。代谢组学dMRM 数据库和方法利用了Agilent 6470 三重四极杆LC/MS 系统的高灵敏度和宽动态范围，以及安捷伦喷射流离子源久经考验的电离增强功能。本应用简报介绍安捷伦代谢组学dMRM 数据库和方法的优势，其针对中心碳代谢物提供一套已经过优化且简单直接的靶向分析方法，让研究人员能够轻松执行分析。结论安捷伦代谢组学动态MRM (dMRM) 数据库和方法专为复杂生物基质中中心碳代谢物的靶向LC/MS 分析而开发。本文采用Agilent 1290 Infinity II UHPLC 与Agilent 6470 三重四极杆质谱仪联用的系统，对该LC/MS 方法进行了优化。这一UHPLC-MS/MS 方法与采集数据库的组合可提供：针对棘手酸性代谢物分析的稳定的最优离子对反相-色谱方法，包括代谢物特定的LC/MS/MS 离子对和保留时间的优化数据库；以及受安捷伦完整代谢组学工作流程支持的默认数据分析方法。代谢组学动态MRM (dMRM) 数据库和方法可实现快速设置并获取优异结果，无需进行分析方法开发。