鸭肉中磺胺间甲氧嘧啶检测方案(固相萃取仪)

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Preekem 全自动固相萃取-高效液相色谱法检测鸭肉中的4种磺胺类药物 编号：ANIET20151022 摘要：参考《GB 29694-2013动物性食品中13种磺胺类药物多残留的测定》标准，建立了利用全自动固相萃取仪结合高效液相色谱检测鸭肉中磺胺类药物的方法。样品经乙酸乙酯提取，正己烷除油，混合型阳离子萃取(MCX)柱净化，转溶定容过滤后，用二极管阵列检测器检测。结果表明回收率良好，重现性高。 关键建：磺胺类药物， EXTRA， HPLC-DAD 1引言 磺胺类药物 (Sulfonamides， SAs)是具有对氨基苯磺勾胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。由于磺胺类药物抗菌谱广、性质稳定、使用方便、价格低廉等优点，其是禽畜抗感染治疗中重要的化学药物之一。由于磺胺类药物在动物体内的作用时间和代谢时间较长，可能在其体内蓄积，而最终由食物链进入人体。其毒性作用主要体现在肾损伤、致肿瘤作用、过敏反应、造血机能破坏、消化系统障碍、免疫抑制、影响中枢神经系统等等。 各国家、地区对动物性食品中的磺胺类药物残留做了一定限量规定：如欧盟规定牛奶和肉类食品中磺胺类药物总量不超过 100 ug/kg；美国规定牛奶中残留限量为 10 ug/L； 我国农业部2002年12月发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》规定牛奶中残留限量为 25 ug/kg， 所有磺胺类药物在牛奶、羊奶及其他可食性组织中的总残留量不能超过 100 ug/kgl21. 本文参考《GB29694-2013食品安全国家标准动物性食品中13种磺胺类药物多残留的测定高效液相色谱法》[3]，建立了利用全自动固相萃取仪(EXTRA)结合高效液相色谱-二极管阵列检测器联用 (HighPerformance Liquid Chromatography-Diode Array Detector， HPLC-DAD)检测磺胺类药物在鸭肉中残留量的方法。在乙酸乙酯提取、正己烷除油后，选用 EXTRA 全自动固相萃取仪，，自动完成SPE 柱活化、样品上样、淋洗、目标物洗脱和收集等步骤，收集液再经氮吹浓缩、溶剂转换、定容后，用HPLC-DAD 检测。 表14种磺胺类药物的分子结构式 Compound CAS Molecular Formula 磺胺氯哒嗪 80-32-0 HN- N=N -I0 磺胺甲基嘧啶 127-79-7 HN_ C 磺胺间甲氧嘧啶 1220-83-3 至 磺胺甲噻二唑 144-82-1 HN-儿 SD 2试剂、仪器及器材 2.1试剂 乙酸乙酯、正己烷、乙腈、甲醇、甲酸：色谱纯级； 0.1 mol/L 盐酸溶液：取0.83mL浓盐酸，用水溶剂并稀释至100 mL； 0.1%甲酸乙腈溶液：取100uL甲酸，用乙腈溶解并稀释至100 mL； 50%甲醇乙腈溶液：取甲醇50mL，用乙腈溶解并稀释至100 mL； 洗脱液：取5mL氨水，用甲醇溶剂并稀释至100 mL； 0.1%甲酸溶液(流动相A相)：取100uL甲酸，用水溶解并稀释至100 mL； 100 ug/mL 磺胺类抗生素标准储备液：分别准确称取标准品 1 mg， 于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100 ug/mL 的磺胺类标准储备液，-20℃以下保存； 实验用水均为超纯水(电屯率=18MQcm)， 取自 Milli-Q 制水机(Millipore， USA)。 2.2仪器及器材 固相萃取柱： MCX， 60 mg/3 mL， 上海安谱公司； 全自动固相萃取仪： EXTRA， 上海屹尧仪器科技发展有限公司； 高效液相色谱仪：：岛津LC-20AD； 0.22 um PVDF针头式过滤器：天津津腾实验设备有限公司； 分析天平；旋涡混合仪；超声波清洗仪；离心机；氮吹仪；移液枪； 50 mL 离心管；10 mL离心管；梨形瓶；玻璃滴管；收集管；样品管； 实验中所用玻璃器皿使用前均经450℃高温灼烧4h后冷却备用。 3 实验方法 3.1前处理方法 3.1.1提取 称取(5.00±0.01)g绞碎均质后的鸭肉样品，置于 50ml离心管中，加入20 mL乙酸乙酯，于旋涡混合仪上混匀2 min， 以3500 r/min 离心5 min， 将上层乙酸乙酯提取液收集于梨形瓶中，样品残渣再加入20mL乙酸乙酯，重复萃取操作，合并乙酸乙酯提取溶液，加入4mL 0.1 mol/L 盐酸溶液，在40℃下水浴减压浓缩至少于3mL。残液转移至10 mL离心管，加入2 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液润洗梨形瓶，溶液合并至10 mL 离心管，离心管中加入3mL正己烷，振荡、静置、分层，弃去上层正己烷。1o下层溶液再加入3 mL正己烷，振荡、静置、分层，弃去正己烷，取下层清液(约5mL)于进样管。 3.1.2净化 MCX 固相萃取柱依次用2 mL 甲醇、2 mL 0.1 mol/L盐酸溶液活化，取备用液过柱，流速1 mL/min/，用1mL0.1 mol/L 盐酸溶液及2 mL 50%甲醇乙腈溶液淋洗固相萃取柱，用4mL洗脱液洗脱，收集洗脱液。 3.1.3定容 收集的洗脱液在40℃水浴中氮气吹干，以0.1%甲酸乙腈溶液定容至 1.0 ml， 以 0.22 um 滤膜过滤，滤液待进样。 3.2检测方法 3.2.1 EXTRA净化程序 EXTRA 净化程序如表2所示。 3.2.2色谱条件 色谱柱为 Kromasil C18柱， 长度250mm， 内径4.6mm， 涂层粒径5.0um； 柱温30℃，流速：；1mL/min，进样量：20.0pL；检测波长：270nm. 流动相为0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如表3，目标物的色谱图如图1，目标物的保 留时间及工作曲线线性范围如表4。 表2全自动固相萃取仪检测鸭肉中磺胺类药物的净化程序 动作 位置 溶剂 体积 抽溶剂速度 打溶剂速度 (mL) (mL/min) (mL/min) 清洗 外针 水 8 90 90 活化 甲醇 2 20 2 0.1 mol/L 盐酸溶液 2 20 2 上样 样品溶液 6 20 1 空气 0.5 60 1 清洗 外针 水 8 90 90 淋洗 0.1mol/L 盐酸溶液 1 20 2 含50%甲醇的乙腈溶液 2 60 2 洗脱 含5%氨水的甲醇溶液 4 20 1 空气 50 60 20 表3流动相梯度洗脱程序 Time (min) A B 0.00 83% 17% 5.00 83% 17% 10.00 80% 20% 22.30 60% 40% 22.40 10% 90% 27.00 10% 90% 28.00 83% 17% 38.00 83% 17% 图1目标物的LC谱图 表4目标物的保留时间、工作曲线线性范围、相关系数 Compound Retion Time Linear Range Linear R2 (min) (ug/L) 磺胺甲基嘧啶 10.543 50-1000 Y=86.2636x+1233.02 0.9987 磺胺甲噻二唑 13.596 50-1000 Y=275.8716x+6200.401 0.9971 磺胺间甲氧嘧啶 16.741 50-1000 Y=184.9521x-824.413 0.9974 磺胺氯哒嗪 17.887 50-1000 Y=119.2813x+4938.496 0.9914 4结果与讨论 4.1基底加标回收率及精密度 在(5.00±0.01)g空白样品中添加一定量的标准混合溶液，使样品中目标物的量达到 500ng (100ug/kg)，考察方法的回收率和重现性。基底加标回收率、相对标准偏差如表5所示： 表5蜂蜜中氯霉素加标(500ng)回收率 Compound Response Calculated Recovery Average RSD (mAU min) (ng) 磺胺甲基嘧啶 39625 473.641 94.73% 94.16% 3.08% 37744 451.836 90.37% 40776 486.984 97.40% 80.90% 5.62% 磺胺甲噻二唑 96601 372.642 74.53% 108800 416.862 83.37% 110779 424.036 84.81% 磺胺间甲氧嘧啶 79061 423.010 84.60% 82.79% 1.69% 77165 412.759 82.55% 75918 406.016 81.20% 磺胺氯哒嗪 51068 469.533 93.91% 96.13% 2.89% 51378 472.132 94.43% 54728 500.217 100.04% 4.2样品检测结果 按照本文所述方法对实际样品进行分析，基底干净无干扰峰，基底加标回收率良好，重现性高。 5结论 本方法采用乙酸乙酯对鸭肉中的4种磺磺类药物进行提取，，全自动固相萃取进行样品净化，有效地去除了样品中的干扰成分，然后利用高效液相色谱-二极管阵列检测器联用进行检测。检测结果表明，该方法抗干扰性强，回收率符合要求，重现性高。 ( 参考文献 ) ( [1]王颖.高效液相色谱法检测动物性食品中磺胺药残留研究[D].扬州大学硕士学位论文，2009. ) ( [2]于淼.养殖业中磺胺类药物残留的危害及现状[J].现代畜牧科技，2015，2：133. ) ( [3] 1 《GB 29694-2013食品安全国家标准动物性食品中13种磺药类药物多残留的测定高效液相色谱法》. )