橙汁中多菌灵检测方案(液相色谱仪)

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[应用纪要]THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要] ■ ■ Waters Michael S. Young， Kim van Tran， Jeremy C. Shia， Jennifer A. Burgess， Lauren Mullen和Kenneth J. Fountain沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用优势 使用经认证的QuEChERS方法对橙汁进行快速萃取 ■无需进一步的样品制备，7分钟内实现UPLC/MS/MS检测分析 为LC/UV分析提供直接的SPE净化步骤 ■使用UPLC/MS/MS达到亚ppb水平的检测限 使用LC/UV达到较低ppb水平的检测限 沃特世解决方案 Xevo°TQ质谱 ACQUITY UPLCH-Class系统 ACQUITY UPLC BEHC柱 XBridgeM BEH CigXP色谱柱 DisQuEM试剂袋产品 OasisMCX萃取柱LCMS认证样品瓶 关键词 多菌灵，杀菌剂，固相萃取，橙汁，UPLC/MS/MS， LC/UV， QuEChERS QuEChERS方法通常是在LC/MS或其它色谱分析方法之前，用作水果和果汁的样品制备。最近，在当地市售的橙汁中检测出一种未经注册的杀菌剂残留物勿一——多菌灵。这种果汁是由进口到美国的橙汁浓缩物生产。在本应用纪要中，我们讨论了橙汁中康唑类杀菌剂(包括多菌灵)的样品制备策略。首先，我们使用QuEChERS方法的DisQuE产品进行样品制备，用以检测各种水果、蔬菜和果汁中的杀虫剂含量。结合QuEChERS方法， UPLC/MS/MS可以轻易检测出10 pg/L (ppb)包括多菌灵在内的五种康唑类杀菌剂，且无需进行进一步的样品制备操作。QuEChERS提取液可以作为前体样品，然后进一步净化并使用液相色谱UV检测器分析其中ppb水平的多菌灵和其他康唑类杀菌剂目标分析物。利用Oasis MCX小柱进行固相萃取 (SPE)可对待测物进行富集，并减少基质干扰。该方法通过使用配备UV检测的液相色谱可完成多菌灵样品在低ppb水平的准确定量。Oasis MCX净化操作虽然不是UPLC/MS/MS分析的必需步骤，却能够减少基质效应而得到更加洁净的提取物。因此，使用QuEChERS方法DisQuE产品制备的样品适用于UPLC/MS/MS直接分析，及经混合模式SPE富集和净化之后的HPLC/UV测定。 图1.康唑类杀菌剂的结构。 实验 用作质谱分析的UPLC条件用作XP色谱UV分析的HPLC条件系统： ACQUITY UPLC H-Class系统： ACQUITY UPLC H-Class色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C检测： PDA检测器2.1×100mm， 1.7 pm色谱柱： XBridge Ci； XP(部件编号：186002352)4.6×100 mm， 2.5 um进样量： 10pl(部件编号：186006039)温度： 40℃进样量： 50pL流动相A： 0.1%NHOH水溶液温度： 40℃流动相B： 0.1% NHOH甲醇溶液流动相A： 20mM磷酸钾水溶液流速： 0.40 mL/min(pH6.8)梯度： 流动相B初值为10%，4分流动相B： 乙腈钟内线性梯度增至90%，流速： 1.3 mL/min保持5分钟，降回至10%B，梯度： 25%B的初值保持3.4分持续5.1 min。保持并再平钟，9.7分钟内线性梯度衡7分钟。增至65%B，保持11.0分钟，然后线性梯度增加 至95%，保持13.0分钟， 之后降回至25%B， 持续 13.2分。保持并再平衡 18.3分钟。 实验 样品描述 实验中所测定的杀菌剂包括以下几种：多菌灵、噻菌灵、抑霉唑、腈苯唑和苯醚甲环唑。这些分析物的结构如图1所示。他们均为可以吸附在Oasis MCX混合模式阳离子交换吸附剂上的碱性化合物。 样品制备 使用QuEChERS方法进行初步提取 将15mL橙汁样品加到50 mL的离心管内。加入15 mL 1%乙酸乙腈(ACN) 溶液，振摇1分钟。加入为AOAC QuEChERS方法准备的DisQuE试剂(部件编号18600681122))，剧烈摇匀1分钟。然后在3000 rpm下离心5分钟。对于不使用固相萃取，直接进行UPLC/MS/MS分析的样品，将0.5mL上清液加水稀释至1.0mL。QuEChERS初步提取方法如图2所示。 SPE净化 使用Oasis MCX小柱的固相萃取方法可对碱性化合物(例如康唑类杀菌剂)进行净化。准备进行LC/UV分析前(如果需要净化样品)， 从QuEChERS提取物中取2mL上清液，加入6mL 0.01MHCl水溶液，然后混均。使用一根3 cc Oasis MCX柱进行固相萃取净化操作，如图3所示。QuEChERS提取液以酸性水溶液稀释，从而提高混合模式SPE保留，同时水溶液稀释增加了反相保留。 图3.使用3cc小柱(部件编号：186000253) 的Oasis MCX固相萃取方法。 质谱条件 质谱仪： Waters Xevo TQ 表1列出了使用Xevo TQ质谱仪得到的锥孔电压、碰撞能量和多反应监测(MRM)参数。 杀菌剂 MRM 锥孔电压(V) 碰撞能量(eV) 多菌灵 192.00>132.00 30 30 192.00>160.00 30 25 苯醚甲环唑 406.10>110.89 20 55 406.10>250.87 20 30 腈苯唑 337.17>69.84 25 30 337.17>124.83 25 30 抑霉唑 297.10>68.90 35 20 297.10>158.87 35 20 噻菌灵 202.04>130.91 45 30 202.04>174.93 45 25 表1.实验中使用的锥孔电压、碰撞能量和MRM参数。 结果与讨论 使用QuEChERS方法能够在UPLC/MS/MS分析之前有效地萃取康唑类杀菌剂。其中的一种杀菌剂-多菌灵- 未经注册却被确证出现在市售的橙汁样品中。本实验通过质谱分析实现了该化合物在1 ppb的水平上的确证，同时LC/UV检测限也达到了10 ppb水平。研究结果显示，使用了QuEChERS样品制备方法的DisQuE产品，不仅能够对康唑类杀菌剂进行有效的UPLC/MS/MS分析，而且通过适当的净化操作步骤，还能使用LC/UV检测出较低ppb水平的杀菌剂。 以上测定结果也验证了一个重要的结论：对于大部分基质中存在的多种杀菌剂及相关化合物，QuEChERS方法是一种非常有效的样品制备技术。随后的样品净化程度完全取决于分析人员的需求、检测方法的灵敏度和特异性。本文中的分析过程程明，虽然SPE净化步骤只是推荐性而非高效率的UPLC/MS/MS分析所必需的过程，但是另一方面，要实现低ppb水平的多菌灵LC/UV测定，则必须进行包括随后Oasis MCX的固相萃取过程。 不使用SPE净化的UPLC/MS/MS分析 图4是每种杀菌剂的10 ppb加标(多菌灵为1 ppb) 橙汁样羊的UPLC/MS/MS重现图谱。使用外标计算方法所得到的五点基质匹配曲线(未示出)中，所有康唑类杀菌剂的相关系数1(r)都大于0.995。表2汇总了由加标实验得到的结果。 化合物 加标水平 回收率% 抑制比% 康唑类杀菌剂 (ppb) (相对标准偏差%) 多菌灵 10 98.7(1.3) 16.1 噻菌灵 100 94.9(2.3) 28.9 抑霉唑 100 97.3(0.9) 4.0 苯醚甲环唑 100 96.4(0.6) 9.7 腈苯唑 100 97.6(1.6) 8.6 多菌灵 1 94.5(4.2) 11.2 噻菌灵 10 97.8(4.1) 34.0 抑霉唑 10 104(3.7) 15.2 苯醚甲环唑 10 92.6(6.5) 12.1 腈苯唑 10 95.2(4.9) 5.0 表2.使用DisQuE产品的AOAC QuEChERS方法得到的康唑类杀菌剂(n=4)回收率数据。如果使用OasisMCX净化，则离子抑制明显减少(<2%)(数据未显示)。 根据橙汁基质中制备的3份平行样品得到的结果测定康唑杀菌剂的回收率。如表2所示，回收率的范围为92%~110%且相对标准偏差(%)小于7%。回收率实验的具体操作方法：分别在QuEChERS萃取之前和萃取后的果汁样品中进行杀菌剂加标，并将两者所得的MRM峰面积进行对比。基质效应(抑制比%)由QuEChERS萃取后的杀菌剂加标上清液的MRM峰面积与用50：50乙腈/水制备的等量杀菌剂标准品峰面积进行对比得出。 使用SPE净化的LC/UV分析 使用SPE净化的LC/UV回收率与100 ppb水平加标样品的UPLC/MS/MS分析结果相似。图5是使用XP色谱柱的LC/UV方法测定唑霉唑、腈苯唑和苯醚甲环唑所得的色谱图。多菌灵和噻菌灵在可见的280nm至300nm处缺少有效发色团；然而在220 nm处却能达到很高的灵敏度，这在很大程度上是因为使用了紫外可穿透的流动相(磷酸钾)o 图4.通过DisQuE产品萃取后得到的橙汁样品以每种杀菌剂10 ng/g (ppb)(除多菌灵为1 ppb外)加标后得到的UPLC/MS/MS图谱。 图5.橙汁样品经Oasis MCX净化后以100 ng/g (ppb)水平加标(抑霉唑、腈苯唑和苯醚甲环唑)，并用带XP色谱柱的LC/UV测定所得的(220 nm)色谱图。 已测样品的分析 图6是对已测橙汁样品分析得到的LC/UV色谱图。图示表明使用Oasis MCX小柱可获得高水平样品净化效果。上方为未使用SPE净化的色谱图，下方为使用Oasis MCX净化后的色谱图。图7是同时使用QuEChERS方法和Oasis MCX小柱净化后得到的色谱图，以及对相同的样品只使用QuEChERS方法而未使用Oasis MCX小柱净化的UPLC/MS/MS图谱。结果吻合度良好， LC/UV检测至11 ppb的多菌灵，UPLC/MS/MS检测到13 ppb的多菌灵。在受检的橙汁样品中未鉴别出其他杀菌剂。图8是已测样品的UV图谱与ppb标准品得到的参比图谱的对比，证实了橙汁样品中残留物的存在。 图6.已测橙汁样品的LC/UV色谱图。上方色谱图未使用SPE净化，下方色谱图在使用OasisMCX萃取净化后得到。 图7.含已测多菌灵的市售橙汁UPLC/MS/MS和LC/UV方法对比图. 图8.由10 ng/g已测样品和参考标准品得到的UV图谱。 结论 ■DisQuE试剂袋 (QuEChERS) 能够有效地从橙汁中萃取康唑类杀菌剂。 该方法可提供高通量和低检测限的分析，分析过程快速、简单、稳定、安全。 QuEChERS提取液可直接用于UPLC/MS/MS分析，而不用进一步净化。 ■简洁的OasisMCX固相萃取流程为低ppb检测限的多菌灵UV检测提供了有效的样品净化和富集方法。 Oasis MCX固相萃取净化能够增强UPLC/MS/MS的分析性能，即使这一步骤并非必需过程。 经固相萃取净化后的橙汁样品中的多菌灵，其 LC/UV与UPLC/MS/MS分析结果达到一致。 沃特斯中国有限公司沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 ( 上海：021-61562666 广州：020-28296555 ) ( 成戈：028-65545999 ) ( 香港：852-29641800 ) ( 免费售后服务热线：800(400) 820 2676 www.waters.com ) QuEChERS样品制备方法应用于LC/MS和LC/UV测定橙汁中多菌灵和其他康唑类杀菌剂