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AN_C_LC-78 引言 养正消积胶囊为补益剂,具有健脾益肾、化瘀解毒之功效。主治不宜手术的脾肾两虚和瘀毒内阻型原发性肝癌辅助治疗,方剂组成为黄芪、女贞子、人参、莪术、灵芝等,其中女贞子中富含齐墩果酸 (oleanolic acid, 0A)和乌苏酸(熊果酸, ursolic acid,UA)。它们是五环三萜类化合物,广泛存在于自然界。据不完全统计,齐墩果酸以游离形式和与糖结合形式广泛存在于约60个科190种植物【2】,熊果酸以游离形式和与糖结合形式分布于约27个科46个属62种植物,0A和UA作为两个结构非常接近的三萜化合物,两者的分离一直是一个困扰化学工作者的难题。Cig色谱柱分离这两个组分时分离度达不到2.0,而且只有在色谱柱与仪器的状态都较好的情况下分离度才能达到1.5,这样对两者的准确定量造成影响。C3o色谱柱适合用来分析脂溶性的化合物,尤其适合三萜类化合物的分离,本实验采用 acclaim C30 色谱柱分离0A和UA,并与C1g的分离效果进行了对比,验证了Cgo色谱柱对三萜类化合物较强的分离能力。 图1.齐墩果酸和乌苏酸结构 仪器 Thermo U3000 高效液相色谱仪 (Thermo Scientific),超声振荡器 (Thermo Scientific), Thermo Scientific Chromeleon 6.80色谱系统控制软件。 试剂与标准品 醋酸铵为分析纯级别(国药集团),甲醇、乙腈为色谱纯级别 (Fisher Scientific)。所有试剂均作空白实验,符合质量控制要求方可使用。水为超纯水机制备(ThermoScientific)。 标准溶液制备 精密称取齐墩果酸10.8mg、乌苏酸9.9mg,置100mL量瓶中,甲醇溶解,定容至刻度,得含齐墩果酸 0.108mg/mL, 乌苏酸 0.099mg/mL的对照品溶液。 供试品溶液制备 精密称取养正消积胶囊内粉末0.6g, 置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,密塞,称定重量,超声处理40分钟,放冷后再称定重量,用甲醇补足减失的重量,过滤,即得供试品溶液。 色谱条件 流动相: Cao分析条件A:1%醋酸铵,B:乙腈-甲醇(75:25)0min A: B (92:8), 20min A: B (20:80)C18分析条件A:1%醋酸水溶液,B:甲醇·乙腈(70:20)A: B(10:90)流速 1.0mL/min。进样体积:10pL柱温:30℃ 检测器条件: ELSD:evap=65℃, neb=60℃, gas=1.6 SLM 分析柱1: Acclaim 120 C3o (150×4.6mm, 5pm)(PN 075719) 分析柱2: Acclaim 120 C18 (150×4.6mm, 5pm)(PN 059148) 结果与讨论 C30色谱柱测定谱图 图2.C30色谱柱测定谱图 C18色谱柱测定谱图 图 3.C18色谱柱测定谱图 方法的精密度、稳定性和重复性 精密吸取对照品溶液10pL,分别连续进样5次,经C30柱分离后测得0A 和UA2的峰面积 RSD 值分别为 1.43%和1.32%。精密吸取对照品溶液10pL, 分别在0、2、4、6、8和10h进样,测得0A和UA的峰面积RSD值分别为1.73%和1.83%。取养正消积胶囊按照供试品溶液制备项下方法制备供试液3份,注入液相色谱仪,进样量10uL, 0A 和UA的峰面积RSD 值分别为1.49%和1.53%. 方法的线性关系(含量与ELSD 峰面积的关系) 表1.测定结果的对数曲线方程与线性关系 曲线方程 相关系数R 线性范围 (mg/mL) 齐墩果酸 y=13.87x-1.717 0.999 0.02-0.50 乌苏酸 v=30.54x-6.067 0.999 0.02-0.50 以上结果表明 Cgo色谱柱在该含量范围内 ELSD 测定峰面积与含量成良好的线性关系。 样品测定结果 取3批养正消积胶囊囊分用C3o和Cg色谱柱进行测定,0A和UA在C o色谱柱上分离度3.56, Cig色谱柱上1.55。 表2.C30色谱柱测定样品含量结果 齐墩果酸(mg/粒) 乌苏酸 (mg/粒) 两者加和(mg/粒) 110702批 1.59 0.65 2.24 110301批 1.55 0.67 2.22 110102批 1.63 0.70 2.33 表3.C色谱柱测定样品含量结果 齐墩果酸(mg/粒) 乌苏酸 (mg/粒) 两者加和(mg/粒) 110702 批 1.55 0.66 2.21 110301 批 1.50 0.67 2.17 110102批 1.61 0.69 2.30 结论 本方法采用 acclaim Cgo色谱柱测定 OA和UA含量,两者分离度3.56,较C18色谱柱上1.54的分离度有较大改善,能够明确地对两化合物进行定量,本方法可应用于其他品种中0A和UA的含量测定,具有较强的推广意义。 ( 参考文 献 ) ( [1]中国药典,第一部[M ] .北京:中国医药科技出版社, 2015版:1277. ) ( [2 ] 王蓉;邹时英;李艳清;蒋涛;反相高效液相色谱法 同时测定车前草中熊果酸和齐墩果酸[];光谱实验室; 2011年04期. ) ( [3]崔洪泉;蒋秀芳;高效液相色谱法测定山楂药材中齐 墩果酸和熊果酸的含量[J];临床合理用药杂志;2011 年13期. ) 养正消积胶囊为补益剂,方剂组成为黄芪、女贞子、人参、莪术、灵芝等,其中女贞子中富含齐墩果酸(oleanolic acid, OA) 和乌苏酸 ( 熊果酸,ursolic acid, UA)。它们是五环三萜类化合物,广泛存在于自然界。OA 和UA 作为两个结构非常接近的三萜化合物,两者的分离一直是一个困扰化学工作者的难题。C18 色谱柱分离这两个组分时分离度达不到2.0,而且只有在色谱柱与仪器的状态都较好的情况下分离度才能达到1.5,这样对两者的准确定量造成影响。C30 色谱柱适合用来分析脂溶性的化合物,尤其适合三萜类化合物的分离,本实验采用 acclaim C30 色谱柱分离OA 和UA,并与C18的分离效果进行了对比,验证了C30色谱柱对三萜类化合物较强的分离能力。
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