芝麻中黄曲霉毒素检测方案(液相色谱仪)

智能文字提取功能测试中

2 潘媛媛余彦海金燕赛默飞(中国)有限公司 关键词：柱后碘衍生；双三元；黄曲霉毒素 Key words： Post-column Derivatization； DGLC； Aflatoxins 引言 黄曲霉毒素(AFT)是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉(aspergillus flavus) 寄生曲霉(a.parasiticus ) 产生的次生代谢产物，是目前粮油中毒性最大、波及面最广的霉菌毒素之一。B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物，与致癌性有关。黄曲霉毒素的主要分子型式含B1、B2、G1、G2、M1、M2等。 图15种黄曲霉毒素 样品前处理 GB2761-2005中规定我国玉米、花生等粮油中黄曲霉毒素B1的最高残留量限值是≤20ug/kg， GB/T 18979-2003中规定了食品中黄曲霉毒素测定的标准方法，其中采用免疫亲和柱层析净化-高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1以及黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2总量检出限为1 pg/Kg"。本方法利用双三元高效液相系统(DGLC-3600)，双三元右泵作为分析泵，而左泵作为衍生泵提供衍生试剂，柱温箱提供衍生反应温度，对黄曲霉毒素柱后衍生后，荧光检测器检测。对5种黄曲霉毒素的检出限可达0.013-0.075ug/Kg， 同时满足标准方法及国标限值的检测要求。 准确称取经过磨细的芝麻样品10.0g， 于250mL的具塞锥形瓶中，加入2.0g氯化钠及甲醇/水(70/30)至50mL，震摇提取(约5min)，定量滤纸过滤。准确移取10.0mL滤液，加入40mL水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤2次，保证滤液澄清。 准确移取25mL上述样品提取液上到免疫亲和柱(美国VICAM)上，流速控制在1滴/s。上样完成后，注入20mL水清洗，并将空气通过免疫亲和柱，去除水分。 测试条件 取4mL甲醇洗脱免疫亲和柱，流速为1滴/s。收集全部洗脱液于刻度管中，氮气吹至<0.5mL，用50%甲醇/水定容至1mL，待测。 仪器： UltiMate DGP 3600系统，包括有带在线脱气单元的双三元梯度泵，自动进样器，柱温箱，荧光检测器。配置Dionex reaction coil衍生反应管。 分析柱： Thermo Syncronis C18，5pm， 4.6×150mm 衍生反应管： Reaction Coil 750uL + Reaction Coil375pL 柱温：室温 FLD：激发波长365nm 发射波长435nm 进样量：100pL 流动相：(右泵)22%乙腈+22%甲醇+56%水 流速： (右泵)：0.8mL/min 衍生泵(左泵)：0.2mL/min 图2黄曲霉毒素标准谱图 AFT M1： 2.5pg/L； AFT G1、G2、B1、B2：0.75pg/L 衍生泵(左泵)：0.05%碘溶液 衍生化温度：70℃ 以标样色谱峰面积对浓度做工作曲线，具有良好线性，线性相关系数r大于0.9998。以3倍信噪比计算检出限，得到该方法最低检出限为0.013-0.075pg/Kg。线性数据及检出限见表1所示。检出限及定量限浓度水平的黄曲霉毒素标准谱图见图3和图4。 图3黄曲霉毒素检出限浓度谱图 (AFTM1： 0.075pg/L； AFT G1、G2、B1、B2：0.0225pg/L) 图4定量限水平黄曲霉毒素重复性 实际样品的分析 芝麻样品及其加标样品的重叠谱图见图5，加标回收率见表2。 图5芝麻样品及加标对比谱图 (加标量AFTM1： 5ug/L； AFT G1、G2、B1、B2： 1.5ug/L) 表2样品加标回收实验结果 检测值 加标量 ug/L 加标后浓 度ug/L 加标回 收% AFT M1 NA 5.0 4.56 91.2 AFT G2 NA 1.5 1.25 83.0 AFT G1 NA 1.5 1.47 98.0 AFT B2 NA 1.5 1.45 96.4 AFT B1 NA 1.5 1.46 97.4 ( AFTM1：0.25pg/L；AFT G1、G2、B1、B2：0.075pg/L) 表15种黄曲霉毒素线性范围及检出限 时间 C0 C1 线性范围 LOD LOQ 相关系数 (S/N=3) (pg/Kg) (S/N=10) RSD(%) min (Offset) (Slope) (pg/L) 黄曲霉毒素M1 7.589 0.9994 6.4397 5005.3058 0.5-15 0.075 1.8 黄曲霉毒素G2 8.709 0.9997 1345.6901 18171.8937 0.15-4.5 0.02 4 黄曲霉毒素G1 10.213 0.9997 1290.9989 13835.0040 0.15-4.5 0.025 0.6 黄曲霉毒素B2 11.418 0.9999 68.7725 46151.0730 0.15-4.5 0.013 0.1 黄曲霉毒素B1 13.626 0.9999 95.7629 36853.7696 0.15-4.5 0.016 2 本方法利用双三元液相色谱系统左右两个泵的附注作用，实现了黄曲霉毒素柱后碘衍生一荧光检测。其中左泵做衍生泵，右泵做分析泵，柱温箱提供70℃的衍生反应温度，在一套系统上即可实现柱后衍生，大大节省了试验成本，方法易操作，重现性高，回收率好。 本实验完全采用国标方法GB/T 18979-2003的实验条件，柱后碘衍生实现了芝麻中黄曲霉毒素的测定，水样2.5mL进样，检出限可达0.013-0.075pg/Kg，灵敏度高。本方法同样适用于国标方法规定的其他食品如玉米、花生及其制品、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。 ( [1 ] . GB 2761-2005《食品中真菌霉素限量》 ) ( [2 ] . G B /T 18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析柱净化高效液相色谱法和荧光光度法》 ) thermoscientific.com ( C 2012 T h e rmo Fishe r Scie n tific Inc . Al l ri g hts reserved. All trademarks are the pro p erty of Thermo Fisher Scientific Inc. a nd its s ubsidiaries. Specifications， terms a nd p r icin g are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your ) local sales representative for details. 北京 免费服务热线： 上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118 邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118 ThermoFisherSCIENTIFIC oThermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.上海 黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉（aspergillus flavus）寄生曲霉（a.parasiticus）产生的次生代谢产物，是目前粮油中毒性最大、波及面最广的霉菌毒素之一。B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物，与致癌性有关。黄曲霉毒素的主要分子型式含B1、B2、G1、G2、M1、M2等。GB2761-2005中规定我国玉米、花生等粮油中黄曲霉毒素B1的最高残留量限值是≤20 μg/kg，GB/T 18979-2003中规定了食品中黄曲霉毒素测定的标准方法，其中采用免疫亲和柱层析净化-高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1以及黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2总量检出限为1 μg/Kg[1]。本方法利用双三元高效液相系统（DGLC-3600），双三元右泵作为分析泵，而左泵作为衍生泵提供衍生试剂，柱温箱提供衍生反应温度，对黄曲霉毒素柱后衍生后，荧光检测器检测。对5种黄曲霉毒素的检出限可达0.013-0.075 μg/Kg，同时满足标准方法及国标限值的检测要求。