杏仁、榛子、花生和开心果中真菌毒素及其他真菌代谢物检测方案(液相色谱仪)

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Elisabeth Varga、Franz Berthiller、 Rudolf Krska、 Rainer Schuhmacher 和 Michael SulyokChristian Doppler 真菌毒素代谢实验室与分析化学中心，农业生物技术系 (IFA-Tulln)，自然资源与生命科学大学， 奥地利维维纳(BOKU) Thomas Glauner 安捷伦科技有限公司 Waldbronn， Germany 使用 UHPLC/MS/MS 对杏仁、榛子、花生和开心果中的191种真菌毒素及其他真菌代谢物进行筛查和定量分析 应用简报 本应用简报介绍了用于测定杏仁、榛子、花生和开心果中的191种真菌毒素及其他真菌代谢物和验证测定结果的多目标方法的开发。除受欧盟监管的所有真菌毒素以外，该方法还涉及到常在食品中发现的许多真菌毒素。该方法包括酸化的乙腈-水混合液的简单萃取、原萃取液的稀释以及 UHPLC/MS/MS的测定。采用溶剂标准品对所有化合物进行校准。 此外，本应用简报还介绍了对四种测试基质中65种最重要的真菌毒素进行的部分验证工作。该方法表现出优异的灵敏度，能够检出花生中低至0.04 pg/kg 的恩镰孢菌素B3，并具有良好的重现性，大多数分析物的标准偏差均小于10%。大约60%的基质-分析物组合获得了70%-120%的表观回收率。回收率较低的原因包括萃取回收率较低(例如伏马菌素类)或几种较早流出的分析物所存在的信号抑制。少数情况下存在信号增强效应，因此导致表观回收率较高。 该方法适用于受天然污染的坚果样品分析，总共能够鉴定出40种不同的真菌代谢物。有趣的是，最常检出的毒素并非当前受欧盟监管的化合物，而是白僵菌素、恩孢菌素B和巨孢子素。污染最严重的榛子样品中包含26种不同的毒素。全部结果在 Varga 等人的文章中有更详细的介绍[1]。 真菌毒素是真菌的次生代谢产物，可对人和动物产生急性或慢性毒性作用。由于耕种和储存过程中可能发生真菌的集落，因此谷物、坚果、水果、香料和咖啡等各种饲料和食品中均可找到真菌毒素[2]。真菌毒素归入不同的化学类别，会表现出差异极大的理化特性。在目前已鉴定出的几百种真菌毒素中，大约十二种被认为具有严重的健康危害，故在食品和饲料中受到监管。欧盟委员会法规(EC)1881/2006及其修正案中规定了食品中黄曲霉毒素、呕吐毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素A、展青霉素和玉米烯酮的最高含量[3]。此外，欧盟委员会2013/165/EU 建议中还规定了指示性含量，我们应该据此对呈现T-2和 HT-2毒素的因素进行调查[4]。这些化合物包含在常规监测项目中(如根据国家食品安全局等部门的规定)，且有这些真菌毒素在不同商品食物中存在的数据。对共存真菌毒素进行同时定量分析时，单一目标方法一直以来都被基于 LC/MS 的多目标分析方法所取代。现代三重四极杆仪器的性能改进以及软件工具的开发(例如安捷伦动态 MRM 功能，该功能有助于分析人员更轻松地开发并完善大量目标化合物的快速分析方法)促进了这一趋势的发展。 多目标分析方法的挑战在于需要从各种食品中高效萃取出理化特性大不相同且天然存在的毒素浓度差异极大的分析物。已开发出的多数多目标分析方法针对的是未加工谷物中真菌毒素的筛查[5]，而缺少关于坚果等其他基质中真菌毒素污染的全面信息[1]。 坚果是由硬壳和种子组成的干果。按植物学的理念，真正的坚果是指果皮不开裂的种子。以食品的背景，使用的“坚果”这一术语并没有那么严格，甚至其中包括的杏仁在植物学上属于核果，而花生实际上属于豆类。为简单起见，本应用简报中研究的所有四种基质(杏仁、榛子、花生和开心果)均称为坚果。尽管田间的农产品最常受到镰刀菌属、链格孢属与枝孢属真菌的感染，但曲霉属、青霉属和木霉属真菌却是储存过程中腐败的主导因素[6]。现有的大部分数据是来自坚果中产生的黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A；而关于其他真菌毒素污染的信息则非常有限。 本应用简报介绍了用于坚果中191种真菌毒素和真菌代谢物定量分析的 UHPLC/MS/MS多目标方法。该方法为采用酸化的乙腈-水混合液进行单次萃取，然后稀释原萃取液以进行后续测定。本文就杏仁、榛子、花生和开心果中65种最重要污染物的方法性能参数进行了示范性的展示。该方法采用了从奥地利和土耳其市场上购买的多种坚果。在 Varga 等人的文章中[1]对这种方法及其获得的结果进行了更为详细的介绍。 实验部分 试剂、参比化合物和坚果样品 所有试剂和溶剂均为 HPLC 或 LC/MS级。乙腈、甲醇和乙酸购自VWR International(奥地利维也纳)；乙酸铵购自 Sigma-Aldrich(奥地利维也纳)。超纯水产自 MilliQ Plus系统(法国莫尔塞姆)。真菌毒素分析标准品购自 Alexis Austria(奥地利维也纳)、Alfarma (捷克共和国布拉格)、Axxora Europe(瑞士洛桑)、Bioaustralis (由德国 Tebu-Bio 经销)、 Iris Biotech GmbH(德国马克特雷德维茨)、LGC Promochem GmbH(德国韦塞尔)、Romer Labs (奥地利图尔恩)和 Sigma-Aldrich，或由世界各地的研究团队提供分离菌。 标准储备溶液的配制方法为根据物质的理化特性不同，将参比化合物溶解于乙腈、甲醇、水或其混合物中。将单独的标准溶液混合制成最多含有13种目标化合物的中间稀释液。在使用前，将这些中间稀释液混合制成多分析物工作溶液，后者用于校准和空白坚果基质的加标。标准储备溶液以及中间稀释液在使用之前于-20℃下储存。用乙腈/水/乙酸 (20：79：1，v/v/v) 的混合液逐级稀释工作溶液以制得校准样品。 坚果样品购自奥地利和土耳其不同地区的多家商店。所有样品在使用前均于-20℃ 下储存。样品去皮后采用电动捣碎机进行研磨。称取5.00g(±0.01 g)样品于 50mL 聚丙烯管中，并加入20 mL萃取溶剂(乙腈/水/乙酸，79/20/1，v/v/v)。将样品置于旋转摇床上，于室温下萃取90分钟(200rpm)。当固体残余物沉淀后，用相同体积的稀释溶剂(乙腈/水/乙酸，20/79/1，v/v/v)对500 pL原萃取液进行稀释，最终为8倍稀释。 选择四种待分析坚果中每一种的一个空白样品，并使其完全均质化。在萃取之前，分别向每种各三份样品中加入中等浓度的多分析物工作溶液。将溶剂蒸发后，按上述步骤对加标样品以及空白样品进行萃取。向空白样品的原萃取液中加入不同浓度的多分析物工作溶液以评估电喷雾电离模式下的基质效应，并通过比较萃取前后加标样品的表观回收率对萃取回收率进行评估。 设备 采用 Agilent 1290 Infinity UHPLC 系统进行分离，该系统包括： Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) Agilent 1290 Infinity 高性能自动进样器 (G4226A) Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) 该 UHPLC 系统与配备安捷伦喷射流电喷雾离子源的 AgilentG6460A 三重四极杆质谱仪联用。采用 Agilent MassHunter 工作站 B.06.00软件进行数据采集和分析。 方法 表1总结了1290 Infinity UHPLC条件，表2总结了6460三重四极杆系统工作参数。采用 MassHunter Optimizer 软件通过参比标准溶液的流动注射来实现极性的选择、母离子和子离子的鉴定以及对碎裂电压和碰撞能量的优化。对多数分析物来说采用两个质量离子对进行监测，以遵从欧盟委员会2002/657/EC 决议中规定的鉴定标准[Z]。在两次连续分析中采用正离子和负离子电喷雾离子化于动态多反应监测 (DMRM)模式下进行分析。所有的离子对和实验条件的完整列表以及所有分析物的保留时间请参见文献[1]。 UHPLC 色谱柱 Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱， 2.1×150 mm， 1.8pm(部件号959759-902)， 25C 流动相 A： 5mM乙酸铵，溶于甲醇/水/乙酸(10/89/1，v/v/v)中 B： 5mM乙酸铵，溶于甲醇/水/乙酸 (97/2/1，v/v/v)中 梯度程序 分钟 %B 18.5 100 18.6 0 停止时间 21 min 流速 0.25 mL/min 进样量 5 pL 注射针清洗 采用乙腈/水 (50/50；v/v)清洗 5秒 表2..Agilent 6460三重四干杆系统参数 电离模式 配备安捷伦喷射流的正/负电喷雾离子源 扫描类型 动态 MRM 干燥气温度 200°C 干燥气流量 8L/min 雾化器压力 40 psi 鞘气温度 350°C 鞘气流速 11 L/min 毛细管电压 3500 V 喷嘴电压 500V(正离子)；0V(负离子) 循环时间 750 ms MRM 总数 304(正离子)； 70(负离子) 最大MRM 并发数 36(正离子)；8(负离子) 最短驻留时间 17.3ms(正离子)；90.2(负离子) 最长驻留时间 371.5 ms(正离子)；750(负离子) 分辨率 Unit 采用 MassHunter 定量分析软件对数据进行评估。采用纯标准溶液和线性1/x加权校准曲线完成校准。根据较低丰度定性离子对(S/N)>10的信噪比(峰峰比，基于信号高度)计算定量限(LOQ)，同时考虑稀释因子和每种基质的表观回收率。当分析物浓度高于指定的LOQ，保留时间在预期保留时间的±2.5%以内，且定性离子比处于欧盟委员会2002/657/EC 决议所规定的目标范围内，此时才能将实际样品中真菌毒素的鉴定结果报告为阳性[7]。 结果与讨论 UHPLC/MS/MS方法开发 采用1290 Infinity UHPLC 系统与6460三重四极杆质谱仪联用，开发出了一种用于真菌毒素及真菌代谢物筛查和定量分析的全新多目标UHPLC/MS/MS 方法。由于原萃取溶剂会载入许多分析物和预期的基质，故选择150mm的柱长和21分钟的总运行时间。在运行开始时采用大斜率梯度而在运行后期采用小斜率梯度，可达到更出色的分析物分离。图1显示了正离子模式(A)和负离子模式(B)下采集得到的以中等浓度(根据分析物不同，为0.04-250 pg/kg) 加标至榛子样品中的所有目标化合物的色谱图。 对黄曲霉毒素M，和黄曲霉毒素 G，、细胞松弛素C和D、恩镰孢菌素B2和K1或伏马菌素B，和伏马菌素B，的分离非常重要，因为它们为同分异构体，甚至还共享某些 MRM 离子对。这些化合物均实现了基线分离，然而色谱法无法对3-乙酰基-呕吐毒素和15-乙酰基-呕吐毒素进行分离。大体上峰形非常出色，平均峰宽为0.11分钟(半峰宽)。在所选色谱条件下，仅有环孢素 A、C和D以及 HC 毒素等极少数化合物的峰宽>0.3分钟。对于这类化合物以及具有相邻洗脱的异构体，可将动态 MRM 采集时常用1分钟的窗口予以加宽。 以获得丰度最高信号和最高信噪比的极性下对每种分析物进行检测。在正离子模式下，最常用单电荷质子化离子形态作为母离子。由于某些真菌毒素易形成钠加合离子，而后者通常在碰撞诱导解 离下表现出较弱的裂解效应，因此向流动相中加入乙酸铵以促进并稳定铵加合物的形成。对于少数几种化合物，采用双质子化离子形态或源内碎片作为母离子，因为这些离子优势形成于电喷雾电离过程中。负离子模式下的主要母离子为去质子化离子形态，占全部化合物中的大约20%，在选择乙酸盐加合物作为母离子时可获得丰度最高的信号。 每种化合物选择两个质量离子量， MassHunter 数据分析软件牛自动选择丰度更高的离子对作为定量离子对，再加上另一对作为定性离子对。在较低丰度离子对的信噪比明显较高的情况下，也可选择该离子对作为定量离子对。根据欧盟委员会 2002/657/EC决议中规定的限值[7]，系统将按峰面积计算定性离子对与定量离子对之比，并自动标记违规值。 方法性能表征 由于坚果类商品是欧盟食品和饲料快速预警系统 (RASFF)中的主要投诉来源，并且除黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A以外的真菌毒素可用数据非常有限，因此本方法针对坚果进行了开发与验证。通过在萃取前向杏仁、榛子、开心果和花生的空白样品中加标来获得方法性能参数。通过对萃取后空白样品的原萃取液进行加标来评估基质效应。比较以上两个样品组，可计算出萃取步骤的回收率。65种最重要分析物(受监管的真菌毒素、受天然污染的坚果中检出的真菌毒素以及在其他商品中经常检出的真菌毒素)的性能参数以及所有测试基质均在文献[1]中有详细描述。 响应 响应 图2显示了正离子化模式下采集的黄曲霉毒素B， (A)、白僵菌素(B)和霉酚酸 (C)以及负离子化模式下采集的交链孢酚(D)、大黄素(E)和玉米烯酮(F)的校准曲线。 黄曲霉毒素B，一7个浓度，已使用7个浓度，7个点，已使用7个点， 0QC 交链孢酚-7个浓度，已使用7个浓度，7个点，已使用7个点， 0 QC 浓度(ng/mL) 浓度(ng/mL) 图2.正离子化模式下采集的黄曲霉毒素B，(A)、白僵菌素(B)和霉酚酸(C)以及负离子化模式下采集的交链孢酚(D)、大黄素(E)和玉米烯酮(F)的校准曲线 所有目标真菌毒素获得的线性校准曲线均至少跨越了三个数量级。定量下限(LLOQ)取决于具体化合物，大致处于在亚 ug/Kg 至数百 pg/Kg的范围内。这一范围已经考虑了样品前处理过程中的8倍稀释。由于样品经过了稀释， 且 LLOQ根据较低丰度定性离子对的信噪比计算得出，因此黄曲霉毒素的 LLOQ略高于欧盟委员会2006/1881/EC法规所设定的最大含量[3]。相比之下，看到的玉米烯酮和T-2毒素的 LLOQ则低于其他已发表的多目标物方法。由于方法参数是为所有目标分析物之间实现良好平衡而进行的优化，因此将离子源参数调整到更理想的值便可使特定化合物获得追加的灵敏度。就所选萃取溶剂和色谱条件而言，需要经过平衡以涵盖大量化学性质各不相同的分析物，而针对性更强的方法能够提高特定分析物的灵敏度。提高灵敏度的其他替代方法也许是文献[8]中所述的样品净化(该方法很可能无法同等适用于全部191种分析物)、富集策略或采用更灵敏的检测器(例如Agilent 6490 三重四极杆质谱仪)[9]。 根据萃取前加标的坚果样品获得的结果来计算表观回收率。图3显示的直方图中汇总了四种基基中所有验证化合物的表观回收率。 约60%验证分析物的表观回收率处于70%-120%的范围内。表观回收率的较大实测偏差是由基质效应或萃取不充分引起的。这一结果符合多目标方法的预期，因为该方法涵盖了大量化学性质各不相同分析物，故需要在萃取溶剂和色谱分离之间进行平衡。对四种不同基质而言，多数表观回收率均十分接近，且可重复性极高，几乎所有分析物的标准偏差均低于 10%。 比较萃取前后加标样品的结果来计算萃取回收率。一般来说，已采用的萃取步骤使一半化合物获得了50%及更高的萃取回收率。只看到伏马菌素的萃取回收率较低。 将萃取后加标样品与纯标准溶液相比较，计算信号抑制或增强效应。对于57%的分析物，信号抑制或增强导致了不足20%的信号减小或增大。3-硝基丙酸、曲酸或呕吐毒素等较早洗脱化合物的抑制现象比较严重。相比之下，几种化合物表现出显著的信号增强。大黄素甲醚和伊快霉素测得的信号增强值最大，分别高达295%和285%。已有研究表明，稳定同位素稀释或基质匹配校准是补偿信号抑制或增强的有效策略[9]。对于该方法中有限的几种目标化合物而言，此法可能有用。不过，本方法的主要作用还在于对191种化合物进行简单快速的筛查。 受天然污染的坚果样品中的真菌毒素筛查 该方法用于筛查50多种坚果样品中的真菌毒素。图4显示了受天然污染的榛子样品中检出的几种真菌毒素的色谱图，其中包括黄曲霉毒素、链格孢菌毒素、霉酚酸以及首次在榛子中发现的T-2毒素。 1484.3→185.1 Area=3888 6.5-484.3→215.2 Area=3046 ×102- 339.0→306.0 Area=2043 339.0→324.0 Area=2690 ×102- 801.5→244.0 Area=1270 801.5→262.0 Area=1035 ×103 118.0→46.0 Area=8313 霉酚酸 38 3.4- ×102 2.9- ×102 313.0→285.0 Area=2531 ×103- 338.0→303.0 Area=25718 E F 2.7- G 313.0→128.1 Area=1377 H 338.0→207.0 Area=27620 1- 3.2- 2.5- 4.6- 3.0 4.4- 2.3- C 4.2- D 0.9 2.8- 4.0 4.2- 1.1- 3.8- 0.8- 2.6- 3.6 2.1- 3.8- 3.4- 0.7 2.4- 3.2 3.4- 3.0- 2.2- 2.8 3.0- 2.6 0.6 2.0- 2.4- 2.6- 2.2- 0.5 1.8 2.0- 2.2- 1.8 0.4- 1.6- 1.6- 1.8 1.4- 1.5- 1.0- 1.2- 0.9- 1.4- 1.0 1.0- 0.8- 0.8 0.7 1.0- 0.6- 0.6- 0.5- 0.1- 图4. 一种天然受污染的榛子样品中检出的真菌毒素MS/MS图。(A) 曲酸(1300 ug/kg)、(B)黄曲霉毒素 G1 (22 ug/kg).(C) 黄曲霉毒素 B1 (15 ug/kg)、(D)霉酚酸(570 pg/kg)、(E)T-2毒素(41 pg/kg)、(F)3-0-甲基杂色曲霉素(3.9 pg/kg)， (G)白僵菌素(1.3 pg/kg)、(H)3-硝基丙酸(850 pg/kg)、(1)腾毒素 (2.6pg/kg)、(J) 交链孢酚 (49 pg/kg)、(K)交链孢霉甲基醚(79 ug/kg)和(L)巨孢子素 (340 pg/kg) 所有类型的坚果中找到了40多种不同的真菌毒素。榛子样品中检出的污染物最多(36种)，其次是花生(30种)、杏仁(13种)和开心果(5种)。这可能是由于所分析的榛子样品数量多于其他种类的样品。然而，某一种榛子样品受到了26种真菌毒素的污染，而在其他八种榛子样品中查明有20种甚至更多的真菌毒素。在花生、杏仁和开心果样品中，单一样品中最多分别检出了17种、13种和5种分析物。白僵菌素最常检出，具有42个阳性检测结果，其次是恩恩孢菌素B(33个)、巨孢子素(30个)和3-硝基丙酸(29个)。此外，实验中检出了多种链格孢属真菌毒素，在27个样品中检出了交链孢霉甲基醚，其次是交链孢酚(24个)、腾毒素(22个)和细交链连菌酮酸(21个)。 榛子和花生样品中鉴定出的真菌毒素还包含黄曲霉毒素，欧盟规定了该真菌毒素的最大浓度。对于八个榛子样品和八个花生样品，所测得的黄曲霉毒素B，浓度高于 5 pg/kg的榛子法规限值和2pg/kg 的花生法规限值，最高浓度达到了 15 pg/kg。此外，在分析的22个榛子样品中的21个检出了毒性最强的杂色曲霉素，它是黄曲霉毒素B，的前体，其浓度最高达 5.5 ug/kg。首次在15个榛子样品中鉴定出 T-2和 HT-2毒素，这两种毒素的平均浓度分别为32 pg/kg 和39 pg/kg。 一些榛子样品明显被链格孢属真菌毒素污染，其中交链孢酚的浓度最高达 650 pg/kg， 交链孢霉甲基醚的浓度最高达220 pg/kg。榛子样品中丰度最高的真菌毒素是3-硝基丙酸，所有榛子样品中均检出了这种毒素，浓度最高达980 pg/kg；其次是恩镰孢菌素B， 该化合物在17个样品中检出，浓度最高达 540ug/kg。发现浓度最高的化合物是霉酚酸(一种强效免疫抑制化合物)，该化合物在一种样品中的浓度高达6100 pg/kg。此外，巨孢子素的实测浓度最高达 2200 pg/kg。 在所有花生样品中，白僵菌素的检出浓度最高达 12 pg/kg。某一花生样品中还包含最高浓度的污染物，即40000 pg/kg 的曲酸。杏仁样品中检到了链格孢菌毒素和恩镰孢菌素。测得的最高浓度污染物是环匹阿尼酸，其浓度最高达130 pg/kg， 其次为黑麦酮酸D，其浓度最高达 51 pg/kg。开心果中仅有五种分析物检出，且仅仅一个样品受到浓度高于 LLOQ 的巨孢子素污染。 本文开发出了一种用于测定191种真菌毒素及其他真菌代谢物(包括欧盟监管的所有真菌毒素)的基于 UHPLC/MS/MS的多目标方法。该方法充分利用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统的低延迟体积及其能够在 UHPLC 分离中控制高反压的优势提高了色谱分离度，从而使分析物与基质实现了更彻底的分离。该方法包括快速、简便而经济的溶剂萃取程序以及进一步将稀释的原萃取液进样至UHPLC/MS/MS系统进行分析的步骤。该方法得益于Agilent 6460 三重四极杆质谱仪的高灵敏度和高稳定性以及安捷伦喷射流离子源的通用电离功能。采用动态 MRM 的采集法能最大限度延长每种化合物的驻留时间，并通过优化离子源参数以在一系列目标化合物之间实现良好平衡。 对杏仁、榛子、花生和开心果中所有受监管且最常被检出的65种真菌毒素的方法进行了验证，结果表明该方法能够对这65种真菌毒素进行定量分析。对于其他分析物而言，该方法仍可提供半绽量信息。尽管在坚果上对该方法进行了验证，但该方法也可用于筛查多种其他食品和饲料基质中的真菌毒素。本应用简报所介绍的方法是对单一分析物或组分析物检测方法的适当补充，能够有助于对各种商品食物中真菌毒素的存在状况加以了解。 该方法已应用于分析53种不同的坚果样品，期间已检出了40种不同的真菌毒素和真菌代谢物。除黄曲霉毒素(当前受欧盟监管的唯一一种坚果中的真菌毒素)以外，其他毒素均为坚果中的相关污染物。在50%以上的样品中检测到了白僵菌素、恩镰孢菌素B、巨孢子素、3-硝基丙酸、大黄素和交链孢霉甲基醚，部分化合物的浓度极高。方法首次确认了榛子中HT-2和T-2毒素的存在。检出的许哆真菌毒素尚未经过充分的毒理学评估，此外，关于共存毒素的加合效应甚至协同效应的信息仍然缺失。 ( 参考文献 ) ( 1. E. Varga，et al."Development a n d v a lidation o f a(semi-)quantitative UHPLC-MS/MS method for the deter-mination of 191 mycotoxins and other fungal metabolitesin almonds，hazelnuts， p eanuts and pistachios" Anal. Bioanal . Chem . 405：5087-5104，2013 ) 2. P. Zollner， B. Mayer-Helm“Trace mycotoxin analysis incomplex biological and food matrices by liquid chro-matography-atmospheric pressure ionisation mass spec-trometry"J. Chromatogr. A 1136：123-169，2006 3. Commission Regulation (EC) No.1881/2006 of 19December 2006 setting maximum levels for certaincontaminants in foodstuffs (including amendments as of13 November2012) 4. Commission Recommendation No. 2013/165/EU of 27March 2013 on the presence of T-2 and HT-2 toxin incereals and cereal products ( 5. M. Sulyok， R. Krska， R. Schuhmacher"Ap p lication of aliquid chromatography- t andem m a ss spectrometricmethod i n multimycotoxin determination in raw cereals and evaluation of matrix effects" Food Addit. Contam. 24：1184-1195.2007 ) ( 6. J. 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Varga， et al.， “对采用UHPLC/MS/MS 准确定量玉米中 毒枝菌素的稳定同位素稀释分析方法进行验证”，安捷伦科 技公司应用简报，出版号5991-2808CHCN， 2013 ) 有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站www.agilent.com。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户)联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价：www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2014 2014年8月8日，中国出版 Agilent Technologies     摘要    本应用简报介绍了用于测定杏仁、榛子、花生和开心果中的191 种真菌毒素及其他真菌代谢物和验证测定结果的多目标方法的开发。除受欧盟监管的所有真菌毒素以外，该方法还涉及到常在食品中发现的许多真菌毒素。该方法包括酸化的乙腈-水混合液的简单萃取、原萃取液的稀释以及UHPLC/MS/MS 的测定。采用溶剂标准品对所有化合物进行校准。    此外，本应用简报还介绍了对四种测试基质中65 种最重要的真菌毒素进行的部分验证工作。该方法表现出优异的灵敏度，能够检出花生中低至0.04 μg/kg 的恩镰孢菌素B3，并具有良好的重现性，大多数分析物的标准偏差均小于10%。大约60% 的基质-分析物组合获得了70% - 120% 的表观回收率。回收率较低的原因包括萃取回收率较低（例如伏马菌素类）或几种较早流出的分析物所存在的信号抑制。少数情况下存在信号增强效应，因此导致表观回收率较高。    该方法适用于受天然污染的坚果样品分析，总共能够鉴定出40 种不同的真菌代谢物。有趣的是，最常检出的毒素并非当前受欧盟监管的化合物，而是白僵菌素、恩镰孢菌素B和巨孢子素。污染最严重的榛子样品中包含26 种不同的毒素。全部结果在Varga 等人的文章中有更详细的介绍[1]。前言    真菌毒素是真菌的次生代谢产物，可对人和动物产生急性或慢性毒性作用。由于耕种和储存过程中可能发生真菌的集落，因此谷物、坚果、水果、香料和咖啡等各种饲料和食品中均可找到真菌毒素[2]。真菌毒素归入不同的化学类别，会表现出差异极大的理化特性。在目前已鉴定出的几百种真菌毒素中，大约十二种被认为具有严重的健康危害，故在食品和饲料中受到监管。欧盟委员会法规(EC) 1881/2006 及其修正案中规定了食品中黄曲霉毒素、呕吐毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素A、展青霉素和玉米烯酮的最高含量[3]。此外，欧盟委员会2013/165/EU 建议中还规定了指示性含量，我们应该据此对呈现T-2 和HT-2 毒素的因素进行调查[4]。这些化合物包含在常规监测项目中（如根据国家食品安全局等部门的规定），且有这些真菌毒素在不同商品食物中存在的数据。对共存真菌毒素进行同时定量分析时，单一目标方法一直以来都被基于LC/MS 的多目标分析方法所取代。现代三重四极杆仪器的性能改进以及软件工具的开发（例如安捷伦动态MRM 功能，该功能有助于分析人员更轻松地开发并完善大量目标化合物的快速分析方法）促进了这一趋势的发展。    多目标分析方法的挑战在于需要从各种食品中高效萃取出理化特性大不相同且天然存在的毒素浓度差异极大的分析物。已开发出的多数多目标分析方法针对的是未加工谷物中真菌毒素的筛查[5]，而缺少关于坚果等其他基质中真菌毒素污染的全面信息[1]。    坚果是由硬壳和种子组成的干果。按植物学的理念，真正的坚果是指果皮不开裂的种子。以食品的背景，使用的“坚果”这一术语并没有那么严格，甚至其中包括的杏仁在植物学上属于核果，而花生实际上属于豆类。为简单起见，本应用简报中研究的所有四种基质（杏仁、榛子、花生和开心果）均称为坚果。尽管田间的农产品最常受到镰刀菌属、链格孢属与枝孢属真菌的感染，但曲霉属、青霉属和木霉属真菌却是储存过程中腐败的主导因素[6]。现有的大部分数据是来自坚果中产生的黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A；而关于其他真菌毒素污染的信息则非常有限。    本应用简报介绍了用于坚果中191 种真菌毒素和真菌代谢物定量分析的UHPLC/MS/MS 多目标方法。该方法为采用酸化的乙腈-水混合液进行单次萃取，然后稀释原萃取液以进行后续测定。本文就杏仁、榛子、花生和开心果中65 种最重要污染物的方法性能参数进行了示范性的展示。该方法采用了从奥地利和土耳其市场上购买的多种坚果。在Varga 等人的文章中[1] 对这种方法及其获得的结果进行了更为详细的介绍。    结论    本文开发出了一种用于测定191 种真菌毒素及其他真菌代谢物（包括欧盟监管的所有真菌毒素）的基于UHPLC/MS/MS 的多目标方法。该方法充分利用Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统的低延迟体积及其能够在UHPLC 分离中控制高反压的优势提高了色谱分离度，从而使分析物与基质实现了更彻底的分离。该方法包括快速、简便而经济的溶剂萃取程序以及进一步将稀释的原萃取液进样至UHPLC/MS/MS 系统进行分析的步骤。该方法得益于Agilent 6460 三重四极杆质谱仪的高灵敏度和高稳定性以及安捷伦喷射流离子源的通用电离功能。采用动态MRM 的采集法能最大限度延长每种化合物的驻留时间，并通过优化离子源参数以在一系列目标化合物之间实现良好平衡。    对杏仁、榛子、花生和开心果中所有受监管且最常被检出的65 种真菌毒素的方法进行了验证，结果表明该方法能够对这65 种真菌毒素进行定量分析。对于其他分析物而言，该方法仍可提供半定量信息。尽管在坚果上对该方法进行了验证，但该方法也可用于筛查多种其他食品和饲料基质中的真菌毒素。本应用简报所介绍的方法是对单一分析物或组分析物检测方法的适当补充，能够有助于对各种商品食物中真菌毒素的存在状况加以了解。    该方法已应用于分析53 种不同的坚果样品，期间已检出了40 种不同的真菌毒素和真菌代谢物。除黄曲霉毒素（当前受欧盟监管的唯一一种坚果中的真菌毒素）以外，其他毒素均为坚果中的相关污染物。在50% 以上的样品中检测到了白僵菌素、恩镰孢菌素B、巨孢子素、3-硝基丙酸、大黄素和交链孢霉甲基醚，部分化合物的浓度极高。方法首次认了榛子中HT-2 和T-2 毒素的存在。检出的许多真菌毒素尚未经过充分的毒理学评估，此外，关于共存毒素的加合效应甚至协同效应的信息仍然缺失。