水，土壤和沉积物中有机酸检测方案(气相色谱仪)

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应用简报 Agilent食品检测Trusted Answers 挥发性有机酸和脂肪酸分析的对比研究 使用 DB-FATWAX超高惰性色谱柱及其他 WAX气相色谱柱 Yun Zou 安捷伦科技(上海)有限公司 本应用简报评估了 Agilent J&W DB-FATWAX超高惰性气相色谱柱在 C2-C7 游离脂肪酸水溶液、C2-C18 有机酸和 Agilent WAX UI 测试混标分析中的性能。DB-FATWAX超高惰性气相色谱柱对水性基质的重复进样具有出色的稳定性。与 Agilent J&W DB-FFAP气相色谱柱等酸改性的 WAX 色谱柱相比， DB-FATWAX UI 色谱柱能够使短链挥发性有机酸获得与之相当或更出色的峰形。结果表明与其他市售 WAX 色谱柱相比，DB-FATWAX UI 柱在分析未衍生挥发性有机酸和游离脂肪酸时，具有卓越的惰性、热稳定性和保留时间重现性。 前言 监测挥发性有机酸和脂肪酸的种类是食品、香精、酒精饮料和其他行业中经常需要使用的分析方法。在生命科学研究中，实验室通常通过分析细菌培养基中提取出的脂肪酸谱来鉴定细菌。还会经常对发酵中的厌氧或好氧消化的短链有机酸 (C2至C7)进行监测。这一过程可以采用顶空/气相色谱结合，或液液萃取然后再通过气相色谱分析的方法。最常见的方法是直接进样各种酸的水溶液。未衍生挥发性有机酸很难采用气相色谱分析来进行定量，因为这些强极性化合物与色谱柱上的活性位点有较强的相互作用，导致拖尾或峰分离变差，增加低浓度下的定量分析难度。对某些酸，这些吸附是不可逆的。直接进样方法需要采用在强酸和水中不会分解的气相色谱固定相。 通常，会将脂肪酸衍生化为甲酯进行分析。为鉴定和定量食品行业的消费品，常规方法是通过测定脂肪和油中各种饱和与不饱和脂肪酸的比例来分析脂肪酸甲酯。而这些预处理步骤繁琐而耗时，而且有可能会出现酸未完全转化为酯以及提取流程中短链脂肪酸甲酯损失的情况。因此，为了避免衍生化、提取和纯化等相关步骤出现问题，推荐对未衍生的有机酸和游离脂肪酸进行分析。这些脂肪酸通常在游离状态即可进行分析，可采用两种类型的气相色谱柱：一种是酸改性 WAX 色谱柱(例如 FFAP色谱柱)，另一种是超高惰性 WAX色谱柱。 之前的文章中已经详细介绍过使用DB-FATWAX UI 色谱柱对 FAME 进行气相色谱分析4.5。本应用简报将讨论使用 DB-FATWAXUI、DB-FFAP 和其他 WAX 色谱柱分析游离脂肪酸。 试剂与标准品 测试混标中的所有标准品和试剂均购自上海安科学仪器有限公司。每种标准品和溶剂的纯度均高于98%。混标由各单标纯品制备而成。 WAX 超高惰性测试混标°由表1列出的12种化合物组成，并采用表4中的色谱条件进行分析。 表 1. WAX UI测试混标，以二氯甲烷为溶剂 峰编号 化合物 上样量(ng) 1 2-壬酮 3.3 2 癸醛 3.3 3 丙酸 3.3 4 乙二醇 3.3 5 十七烷 1.65 6 苯胺 3.3 7 月桂酸甲酯 3.3 8 2-氯酚 3.3 9 1-十一醇 3.3 10 十九烷 1.65 11 2-乙基己酸 6.6 12 乙基麦芽酚 6.6 仪器 在配备火焰离子化检测器 (FID) 的 Agilent7890B气相色谱仪上进行。使用配备5uL进样针(部件号 G4513-80213)和分流/不分流进样口的 Agilent 7683B自动液体进样器进样。表2-4汇总了仪器配置参数与分析条件。表5列出了本研究中使用的其他备件。 参数 值 气相色谱系统 7890B/FID 色谱柱 J&W DB-FATWAX 超高惰性柱， 30 m， 0.25 mm， 0.25 pm (部件号 G3903-63008)J&W DB-FFAP柱， 30 m，0.25 mm， 0.25 pm(部件号122-3232) 供应商1和2的市售 WAX 色谱柱， 30 m， 0.25 mm， 0.25 pm 载气 氦气，42cm/s， 恒流模式 进样口 分流/不分流，250℃，分流比30：1 柱温箱 162°℃恒温 FID 250℃，氢气：40 mL/min；空气： 400 mL/min；尾吹气：25mL/min 样品 0.06%-0.13%各酸的水溶液 进样量 0.1pL 表3.方法2实验条件 (C2-C18有机酸) 参数 值 气相色谱系统 7890B/FID 色谱柱 J&W DB-FATWAX 超高惰性柱， 30 m， 0.25 mm， 0.25 pm (部件号 G3903-63008)J&W DB-FFAP 柱， 30 m， 0.25 mm， 0.25 pm (部件号122-3232)供应商1和2的 WAX 色谱柱， 30 m， 0.25 mm，0.25pm 载气 氦气， 42 cm/s， 恒流模式 进样口 分流/不分流，280℃， 分流比 50：1 柱温箱 120℃(保持2min)， 以5℃/min升至140℃(保持3min)； 以20℃/min 升至250℃(保持10 min) FID 280℃， 氢气：40mL/min； 空气：400mL/min；尾吹气：25mL/min 样品 0.05%-0.1%各组分的二氯甲烷溶液 进样量 1pL 表4.方法3实验条件 (WAXUI测试混标) 参数 值 气相色谱系统 7890B/FID 色谱柱 J&W DB-FATWAX超高惰性柱， 30 m，0.25 mm，0.25 pm (部件号 G3903-63008)J&W DB-FFAP柱， 30 m， 0.25 mm， 0.25 pm (部件号122-3232)供应商1和2的WAX色谱柱， 30 m， 0.25 mm，0.25 pm 载气 氦气，40 cm/s， 恒流模式 进样口 分流/不分流，250℃， 分流比75：1 柱温箱 130℃恒温 FID 250℃， 氢气：40 mL/min；空气： 400mL/min；尾吹气：25 mL/min 进样量 0.5 pL 表5.流路备件 备件 描述 样品瓶 棕色，带书写签，经认证，2mL， 螺口盖样品瓶套装(部件号5182-0554) 隔垫 不粘连 BTO隔垫(部件号5183-4757) 柱螺帽 手拧式，进样口/检测器(部件号5190-6194) 密封垫圈 15%石墨：85% Vespel， 短型，内径0.4mm， 用于0.1-0.25 mm色谱柱(10/包，部件号5181-3323) 衬管 带玻璃毛的安捷伦超高惰性分流衬管(部件号5190-2295) 进样口密封垫 超高惰性，镀金，带垫圈(部件号5190-6144) C2-C7游离脂肪酸水溶液测试混标 通过 C2-C7游离脂肪酸样品水溶液15次进样，对分析的重复性和色谱柱性能的稳定性进行了测试。图2表明，水溶液样品重复进样不会导致保留时间稳定 性的漂移问题。在分析过程中也可保持良好的峰形。保留时间的相对标准偏差(RSD) 小于 0.03%，且所有游离脂肪酸的绝对峰面积的 RSD 均在2%以内。 气相色谱直接进样测定溶于水中的游离脂肪酸，是非常具有挑战性的分析。由于存在强酸和水，常规的WAX型固定相变得不稳定而活跃，会导致峰形和重现性变差并降低色谱柱使用寿命。为了避免衬管中气化体积过载，水溶液样品的进样量应小于1pL。 图1所示为 C2-C7游离脂肪酸混合物在J&W DB-FATWAX 超高惰性 (UI)色谱柱上获得的 GC/FID 色谱图。表2列出了分析条件。鉴于 DB-FATWAXUI气相色谱柱的超高惰性，所有酸均得到良好分离，且峰形尖锐对称。 图1. C2-C7 游离脂肪酸水溶液混合物在30 mx0.25 mm内径，0.25 um J&W DB-FATWAX超高惰性色谱柱上获得的 GC/FID色谱图(条件列于表2) 图2.与图1相同的C2-C7 游离脂肪酸水溶液样品重复进样的 GC/FID 叠加色谱图 DB-FFAP是酸改性的 WAX色谱柱，主要为分析有机酸、游离脂肪酸或需要定量酸性杂质的样品而设计。图3为 C2-C7 游离脂肪酸测试混标水溶液在 DB-FFAP色谱柱和DB-FATWAX UI 色谱柱上获得的色谱图。分析在 DB-FFAP 色谱柱上耗时5分钟左右，在 DB-FATWAX UI 色谱柱上则需要6分钟。两种色谱柱均能使样品中所有酸获得良好的峰形和分离度。表6为色谱图中每个峰在10%峰高处的峰不对称性(10%吸收值)； DB-FATWAX UI柱的10%吸收值为 0.98-1.16， DB-FFAP柱为 0.91-1.20。 DB-FATWAX UI柱能够为乙酸(峰1)和异丁酸(峰3)提供更对称的峰形。 使用其他两种不同供应商的市售 WAX型色谱柱在相同的条件下进行了同样的测试。观察到其他供应商的 WAX 色谱柱在分析C2-C7 游离脂肪酸混合物水溶液时出现了峰拖尾(图4和表6)。色谱柱的活性以及固定相的不稳定(特别是供应商1WAX 色谱柱)，导致保留时间漂移、峰分离度变差以及乙酸(峰1)、丙酸(峰2)和异丁酸(峰3)等关键目标分析物响应的丢失。相同结果如图6所示。 图3.C2-C7 游离脂肪酸水溶液样品采用方法1(见表2)， 在30mx0.25 mm 内径， 0.25um J&W DB-FFAP色谱柱和 DB-FATWAX超高惰性色谱柱上分别获得的 GC/FID色谱图 表6.10%峰高(10%吸收值)处的峰不对称性 峰编号 10%吸收值 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DB-FATWAXUI 0.98 1.04 1.15 1.16 1.14 1.08 1.06 1.07 1.04 DB-FFAP 0.91 1.05 1.20 1.16 1.16 1.15 1.09 1.05 1.06 供应商 1 WAX 1.56 共洗脱 共洗脱 1.97 1.65 2.04 1.96 1.96 1.87 供应商1 WAX 0.97 1.08 1.32 1.22 1.28 1.23 1.27 1.26 1.23 1.乙酸 2.丙酸 6.缬草酸7.4-甲基戊酸8.己酸 3.异丁酸4.丁酸 9.庚酸 2，3 5.异戊酸 5 供应商1的 WAX色谱柱 4 6 7 8 9 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min 图4. C2-C7 游离脂肪酸水溶液样品采用方法1(见表2)，在J&W DB-FATWAX UI 色谱柱以及供应商1和2的 WAX 色谱柱上获得的 GC/FID 色谱图 C2-C18有机酸测试混标 图5-7 为 C2-C18有机酸测试混标在J&W DB-FFAP 和 DB-FATWAX UI色谱柱以及其他供应商 WAX 色谱柱上获得的GC/FID 色谱图。测试在色谱柱经250℃下老化50个小时后进行。如图5所示，与 DB-FATWAXUI 柱目比， DB-FFAP柱在高温环境下(250°℃)具有相对较低的柱流失，在洗脱分子量较高的有机酸(例如C18脂肪酸)时分析时间更短。 但是根据图6(图5的放大部分)所示，DB-FATWAX UI 色谱柱能够为 C2-C12挥发性有机酸提供与 DB-FFAP 柱相似甚至更好的峰形。这些挥发性酸能够显著地影响食品的风味与质量，并且这些活性挥发酸的含量是某些食品质量保证的指标。图7显示其他供应商的 WAX 色谱柱在经过50个小时的老化后惰性性能均有不同程度的下降。据报道，供应商2的 WAX色谱柱是惰性 WAX 固定相色谱柱。在这 种色谱柱上，包括同分异构体在内的所有化合物都能够得到分离，但色谱图中的C2-C7 游离有机酸表现出明显的拖尾。供应商1的 WAX 色谱柱是一种典型的常规 WAX 固定相气相色谱柱。供应商1的WAX 色谱柱惰性与热稳定性方面的缺憾导致其产生严重的峰拖尾，尤其是影响了活性 C2-C7 游离脂肪酸和乙酰丙酸的灵敏度、分离度和选择性。 15.癸酸 16.乙酰丙酸 17.月桂酸 18.肉豆蔻酸 19.棕榈酸 20.硬脂酸 21.油酸 22.亚油酸 23.亚麻酸 图5.有机酸(C2-C18)测试混标采用方法2(去表3)， 在 J&W DB-FFAP和 DB-FATWAX UI气相色谱柱上获得的 FID色谱图示例 图6.有机酸(C2-C18)测试混标在 J&W DB-FFAP和 DB-FATWAX UI 气相色谱柱上获得的 GC/FID 色谱图的放大部分(洗脱顺序与图5相同) 图7.有机酸(C2-C18)测试混标在 J&W DB-FATWAX UI 及其他不同供应商的 WAX 色谱柱上获得的 GC/FID 色谱图示例(洗脱顺序与图5相同) Agilent WAX UI 测试混标 DB-FATWAX UI 气相色谱柱是 J&W 超高惰性气相色谱柱系列产品的一员。为了确保这些活性极性化合物的惰性性能，每根色谱柱都经过业界最苛刻的测试混标测试。WAX UI 测试混标包含丙酸、乙基己酸和其他活性化合物。图8和图9为 WAX UI 测试混标在 DB-FATWAX UI、DB-FFAP以及供应商1和2的WAX色谱柱上分离得到的色谱图。目标化合物在DB-FATWAX UI色谱柱上获得了出色的峰形。 DB-FFAP 柱和 DB-FATWAX UI 柱能够为丙酸和2-乙基己酸提供相似的惰性性能，但图8显示 DB-FFAP色谱图上的乙二醇峰有明显的拖尾。吸收值在 DB-FFAP 柱上为0.37，在DB-FATWAX UI 柱上为 0.91。另外，乙二醇在 DB-FFAP 柱上响应明显降低。供应商 2的WAX色谱柱显示出癸醛、丙酸和乙二醇出现峰拖尾，峰不对称性值分别为1.28、1.32和1.26。供应商1的 WAX 色 谱柱的活性造成峰拖尾和某些关键目标分析物(如癸醛、丙酸、乙二醇、2-乙基己酸和乙基麦芽酚)的响应丢失(图9)。 图8. WAX UI 测试混标采用方法3(见表4)， 在 J&W DB-FFAP 和 DB-FATWAXUI 气相色谱柱上获得的 FID色谱图示例 图 9. WAX UI测试混标采用方法3(见表4)， 在J&W DB-FATWAXUI 和其他供应商的 WAX气相色谱柱上获得的 GC/FID 色谱图冬例 通过使用 GC/FID 分析有机酸和 WAX UI测试混标，对 J&W DB-FATWAX超高情性气相色谱柱进行评估。与本报告中评估的其他供应商的 WAX 色谱柱获得的结果相比， DB-FATWAX UI 色谱柱因其高惰性和更出色的热稳定性，可提供更好的峰形和更一致的分析结果，这在短链挥发性有机强酸和水溶液分析时尤其如此。挥发性有机酸和游离脂肪酸在 DB-FATWAXUI和 DB-FFAP气相色谱柱上均得到了良好分离，且峰形对称而尖锐。 DB-FFAP 色谱柱更适用于 C18脂肪酸的分析，因为其在高温(250°℃)下具有更低的柱流失且分析时间更短。用于复杂样品(包括醇类、、二二醇、乙二醇和有机酸)的最佳色谱柱是 DB-FATWAX 超高惰性柱，因为它可以生成更尖锐的峰形，尤其对于大多数的活性化合物，能够提高这些高挑战性分析物的灵敏度和重现性。通过 C2-C7游离脂肪酸水溶液的重现性分析，证明DB-FATWAX UI 柱在水溶液进样时具有绝佳的固定相稳定性。 ( 参考文献 ) ( Merrick-Gass， M.T. GasChromatography in G-Bacteria Identification. American C linica/ Products Review. Dec. 1986 ) ( 2. Henderson， M.H.； Steedman， T.A.Analysis o f C2-C6 monocarboxylicacids in aqueous s olution usinggas chromatography. Journal ofchromatographyA， 244(1982)， 337-346 ) ( 3. Vickers， A.K . High efficiency FAMEs analyses using capillary GC(使用毛细管气相色谱柱高效分析 FAME)。 安捷伦科技公司文献转载，出版号 5989-6588EN， 2007 ) ( Van D er Meer， I ； Zou， Y.； Serrano， G.Analysis of Omega 3 and Omega 6 FAMEs i n Fish O il and Animal Fat Using an Agilent J& W DB-FATWAX Ultra Inert GC Column (使用Agilent J&W DB-FATWAX超高惰性气相色谱柱分析鱼油和动物脂肪中的 w 3 和w6 FAME)。安捷伦科技公司应用简报，出版号5991-8744EN， 2017 ) ( 5. Zou， Y.； W u ， H. 改善对37种脂肪酸甲酯的分析。安捷伦科技公司应用简报，出版号5991-8706ZHCN， 2017 ) ( 6. Dang， N.-A； Vickers， A.K. 惰性更高、 色谱柱使用寿命更长的新型 PEG 气相色谱柱。安捷伦科技公司技术概述，出版号5991-6683CHCN， 2016 ) ( 7. Alur， M.D.； et al. Biochemical methods for determination of spoilage of foods of animal origin： a critical evaluation. Journal of Food Science and Technology (India) 1995， 32，181-188 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 摘要本应用简报评估了 Agilent J&W DB-FATWAX 超高惰性气相色谱柱在 C2–C7 游离脂肪酸水溶液、C2–C18 有机酸和 Agilent WAX UI 测试混标分析中的性能。DB-FATWAX 超高惰性气相色谱柱对水性基质的重复进样具有出色的稳定性。与 Agilent J&W DBFFAP 气相色谱柱等酸改性的 WAX 色谱柱相比，DB-FATWAX UI 色谱柱能够使短链挥发性有机酸获得与之相当或更出色的峰形。结果表明与其他市售 WAX 色谱柱相比，DB-FATWAX UI 柱在分析未衍生挥发性有机酸和游离脂肪酸时，具有卓越的惰性、热稳定性和保留时间重现性。前言监测挥发性有机酸和脂肪酸的种类是食品、香精、酒精饮料和其他行业中经常需要使用的分析方法。在生命科学研究中，实验室通常通过分析细菌培养基中提取出的脂肪酸谱来鉴定细菌。还会经常对发酵中的厌氧或好氧消化的短链有机酸（C2 至 C7）进行监测。这一过程可以采用顶空/气相色谱结合，或液液萃取然后再通过气相色谱分析的方法。最常见的方法是直接进样各种酸的水溶液。未衍生挥发性有机酸很难采用气相色谱分析来进行定量，因为这些强极性化合物与色谱柱上的活性位点有较强的相互作用，导致拖尾或峰分离变差，增加低浓度下的定量分析难度。对某些酸，这些吸附是不可逆的。直接进样方法需要采用在强酸和水中不会分解的气相色谱固定相。通常，会将脂肪酸衍生化为甲酯进行分析。为鉴定和定量食品行业的消费品，常规方法是通过测定脂肪和油中各种饱和与不饱和脂肪酸的比例来分析脂肪酸甲酯。而这些预处理步骤繁琐而耗时，而且有可能会出现酸未完全转化为酯以及提取流程中短链脂肪酸甲酯损失的情况。因此，为了避免衍生化、提取和纯化等相关步骤出现问题，推荐对未衍生的有机酸和游离脂肪酸进行分析。这些脂肪酸通常在游离状态即可进行分析，可采用两种类型的气相色谱柱：一种是酸改性 WAX 色谱柱（例如 FFAP 色谱柱），另一种是超高惰性 WAX 色谱柱。之前的文章中已经详细介绍过使用 DBFATWAX UI 色谱柱对 FAME 进行气相色谱分析。本应用简报将讨论使用 DBFATWAX UI、DB-FFAP 和其他 WAX 色谱柱分析游离脂肪酸。结论通过使用 GC/FID 分析有机酸和 WAX UI 测试混标，对 J&W DB-FATWAX 超高惰性气相色谱柱进行评估。与本报告中评估的其他供应商的 WAX 色谱柱获得的结果相比，DB-FATWAX UI 色谱柱因其高惰性和更出色的热稳定性，可提供更好的峰形和更一致的分析结果，这在短链挥发性有机强酸和水溶液分析时尤其如此。挥发性有机酸和游离脂肪酸在 DB-FATWAX UI 和 DB-FFAP 气相色谱柱上均得到了良好分离，且峰形对称而尖锐。DB-FFAP 色谱柱更适用于 C18 脂肪酸的分析，因为其在高温 (250 °C) 下具有更低的柱流失且分析时间更短。用于复杂样品（包括醇类、二醇、乙二醇和有机酸）的最佳色谱柱是 DB-FATWAX 超高惰性柱，因为它可以生成更尖锐的峰形，尤其对于大多数的活性化合物，能够提高这些高挑战性分析物的灵敏度和重现性。通过 C2–C7游离脂肪酸水溶液的重现性分析，证明 DB-FATWAX UI 柱在水溶液进样时具有绝佳的固定相稳定性。