鸡蛋中致敏肽检测方案(液质联用仪)

智能文字提取功能测试中

「应用纪要1WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要] 采用数据非依赖型离子淌度质谱鉴定和定量鸡蛋中的致敏肽 Lee A Gethings'、Nathalie Gillard2、Antonietta Wallace1、Valery Dumont? 1沃特世公司(英国威姆斯洛)； 2CER Groupe(比利时Marloie) 应用优势 HDMSE可在单次实验中同时采集定性和定量信息。 在工作流程中引入离子淌度技术可提高方法专属性，进而提升鉴定结果的可信度。 该方法有望应用于多过敏原检测。 SYNAPT°G2-Si ACQUITY UPLC°M-Class系统 关键词 简介 食物过敏是人体对某些食物的异常免疫反应引起的。蛋白质是容易触发过敏反应的主要物质。蛋类蛋白质是导致不良食物反应的最常见的物质之一。由于许多加工食品中都含有蛋类原料，因此评估蛋白质结构变化的能力以及生产周期中的蛋白质检测显得格外重要。 使用LC-MS/MS分析食品过敏原是时下许多食品科学家探讨的热门话题，有两种方案可用于开发定量方法。第一种方案是根据数据库(例如UniProt)中可用的fasta序列进行蛋白质模拟酶解，获得可能的酶解肽和MRM通道清单。使用该方法时，分析人员需要开展进一步研究，以针对不同的后期食品加工工艺、样品处理方法以及电离过程确定在可检测响应水平拥有最佳专属性和灵敏度的MRM。另一种方案是使用高分辨率仪器(如QTof质谱仪)开展探究型组学实验，然后利用实验获得的数据开发靶向方法。 本研究运用第二种方案，着重对生鸡蛋和熟鸡蛋样品中的已知致敏蛋白质进行了鉴定和定量分析。使用胰蛋白酶酶解萃取自生鸡蛋和熟鸡蛋样品的蛋白质，然后使用Waters°SYNAPT G2-Si， 运用离子淌度数据非依赖型方法(此方法会在交替扫描期间不断切换低碰碰能量和高碰撞能量状态)采集非标记蛋白质表达数据。 在工作流程中引入离子淌度技术之后，即使面对诸如加工食品样品这样的复杂基质，也能获得更强的专属性，从而提升鉴定结果可信度。系统通过保留时间和漂移时间对齐将母离子与碎片离子关联起来。尽管本研究的重点是鸡蛋蛋白质，但同时也可研究样品制备过程中萃取出来的其它致敏蛋白质，为多过敏原检测提供了一种具有应用潜力的方法。 沃特世解决方案 过敏原，食品组学，蛋白质组学， 发现组学， QTof， 离子淌度 使用Progenesis QI for Proteomics处理采集到的数据，并比对原鸡(Uniprot)数据库进行搜索。根据所得结果可进行相对定量。研究结果表明，熟鸡蛋与生鸡蛋样品组相比，有相当比例的已鉴定蛋白质被表达出来，其中包括已知的致敏蛋白(例如ApovitelleninI)。根据两组样品组中鉴定出的肽可生成MRM通道并分配可量化的值。 样品制备 使用磷酸盐缓冲液(PBS)从蛋类样品中萃取蛋白质，然后通过BCA分析确定蛋白质的初始浓度，之后将蛋白质浓度统一调整为1mg/mL。在使用胰蛋白酶过夜酶解之前，对样品进行还原和烷基化处理。在LC-MS分析前，使用0.22 pm滤膜过滤样品，去除所有颗粒物质，并使用0.1%甲酸进行适当稀释(图1)。 图1.鸡蛋致敏蛋白的实验设计研究。 LC-MS条件 采用非标记LC-MS方法对肽进行定性和定量分析。实验条件如下：使用ACQUITY UPLC M-Class系统，配置ACQUITY UPLCBEH Cig nanoACQUITY肽分析专用柱(10K psi，130A，1.7pm，75 umx150mm， 部件号186003543)，流速300nL/min， 梯度条件为乙腈(含0.1%甲酸)在90 min内从5%升至40%。使用具有离子淌度功能的SYNAPT G2-Si质谱仪，在数据非衣赖型分析(DIA)模式下采集数据。 生物信息学分析 使用Progenesis QI for Proteomics软件处理和搜索LC-MS肽数据，并比对种属特异性的原鸡(Uniprot)数据库进行搜索。蛋白质的错误发现率为4%，除此之外，固定修饰和可变修饰分别包括脲甲基化修饰和甲硫氨酸氧化。 生鸡蛋和熟鸡蛋的蛋白质鉴定及定量 本研究分析了萃取自生鸡蛋和熟鸡蛋样品的蛋白质，对其进行鉴定和定量，并研究了潜在致敏标志物之间的差异。生鸡蛋和熟鸡蛋样品中分别鉴定出95种和84种蛋白质。表1所示为鉴定出的一组蛋白质，以及它们在生鸡蛋和熟鸡蛋萃取物中的含量。SYNAPTG2-Si采用结合了离子淌度(HDMS)技术的数据非依赖型分析方法。HDMS模式的优点是能够改善峰容量和整体专属性，从而尽可能鉴定出最多的蛋白质。图2所示为低能量(与母离子有关)和高能量(与碎片离子有关)示例谱图。 本实验应用了离子淌度技术以提高分析的专属性，因此所得谱图更加清晰(这在分析复杂食品基质时尤为重要)，而且相似物质也得以成功分离，如图3所示，图中展示了停用(关闭)离子淌度和激活(开启)离子淌度时得到的示例谱图。 表1.从生鸡蛋和熟鸡蛋萃取物中鉴定并定量的典型致敏蛋白。 致敏蛋白 生鸡蛋 熟鸡蛋 (ng/uL) (ng/uL) P01005：卵类粘蛋白(OVM) 344.0 333.0 P01012：卵清蛋白(OVA) 44.3 43.8 P02659：脱辅基蛋白(APO) 12.7 5.2 P02789：卵传铁蛋白(OVT) 29.7 5.8 P00698： 溶菌酶(LYS) 6.5 1.0 图2.1ppm浓度下可鉴定出的OVM诊断标志物(m/z846.624，ELAAVSVDCSEYPKPDCTAEDRPLCGSDNK)。 图3.IMS分离对重叠OVT 肽的影响(m/z878.7726，AIANNEADAISLDGG)。如上方谱图所示，生鸡蛋和熟鸡蛋样品中都存在重叠的肽。开启IMS(下方谱图)之后，质荷比相同的母离子得以分离，从而可鉴定两种不同的物质。 在HDMSE模式下使用SYNAPT G2-Si分析蛋糕基质样品可获得极高的肽序列覆盖率(图4)。 图4.从蛋糕基质中鉴定出的P01012卵清蛋白(OVA)和原鸡肽(序列覆盖率为51.8%)。 利用离子淌度降低背景基质效应 为了评估向分析工作流程中引入离子淌度技术带来的性能提升和优势，我们将一系列熟鸡蛋样品稀释液(500~1ppm)加标到浓度相同的曲奇基质中进行分析(图5)。 图5.从加标连续稀释的熟鸡蛋样品溶液的曲奇基质中鉴定出的致敏蛋白。黑色、灰色和蓝色条柱分别代表肽的数量、丰度最高的三种肽的强度之和以及序列覆盖率。图中还展示了加标50 ppm熟鸡蛋样品溶液的曲奇基质的示例色谱图。 FAPAS测试样品-蛋糕混合物 以FAPAS能力测试材料T2770作为测试样品，此材料为购自零售商店的蛋糕混合物，不含鸡蛋和牛奶，但含有谷蛋白。向样品中加入蛋白糖霜，以引入蛋清蛋白质。 经鉴定，样品中的主要过敏原为卵清蛋白(OVA)，其在蛋糕基质中的序列覆盖率(鉴定结果中，组成蛋白质序列的肽所占的百分数)高达51.8%。 进行FAPAS能力测试时，采用ELISA方法进行初步定量分析，鸡蛋的定量结果为39.6~62.1ppm(平均=47.7 ppm)。 LC-MS非标记实验的定量结果为58 ppm， 与ELISA结果一致。得益于HDMSE的独特功能，我们还可以在实验中检测和定量多种过敏原。 结论 本研究应用探究型蛋白质组学工作流程测定了多种可用于定量分析食品中致敏蛋白质的肽标志物。我们采用基于HDMS技术的非标记蛋白质组学方法分析了蛋类过敏原，该技术通过单次实验即可获取定性和定量信息。 将离子淌度技术引入工作流程之后，即使面对诸如加工食品样品这样的复杂基质，也能获得更强的专属性，从而提升鉴定结果可信度。 尽管本研究的重点只是鸡蛋蛋白质分析，但我们还检测到与其它过敏原相关的蛋白质，这表明该方法有望应用于多过敏原检测。 ( 参考文献 ) ( 1. Commission Directive No 2007/68/EC of 27 November 2007 amending Annex Illa to Directive 2 000/13/EC (Official Journal， L310，2 8 /11/2007， 001-0014). ) ( 2 . L i GZ， Vissers JP， Silva JC， Golick D， Gorenstein MV， Geromanos SJ. Database searching and accounting o f multiplexed precursor and production spectra from the data independent analysis ofsimple and complex peptide mixtures. Proteomics. Mar；9(6)：1696-719，2009. ) THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters、 SYNAPT、ACQUITY UPLC、Progenesis和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。@2017年沃特世公司。中国印刷。2017年2月720005891ZH AG-PDF 扫一扫，关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 成戈：028-67653588 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)820 2676www.waters.com 鸡蛋致敏肽的鉴定和定量分析 本研究运用第二种方案，着重对生鸡蛋和熟鸡蛋样品中的已知致敏蛋白质进行了鉴定和定量分析。使用胰蛋白酶酶解萃取自生鸡蛋和熟鸡蛋样品的蛋白质，然后使用Waters SYNAPT G2-Si，运用离子淌度数据非依赖型方法(此方法会在交替扫描期间不断切换低碰撞能量和高碰撞能量状态)采集非标记蛋白质表达数据。