富马酸喹硫平中USP分析方法在不同液相色谱系统上的方法转换检测方案(液相色谱仪)

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「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要 富马酸喹硫平的USP分析方法在不同液相色谱系统上的方法转换 Amanda B. Dlugasch、Jennifer Simeone和Patricia R. 应用优势 用户可使用沃特世方法转换计算器计算可达到相当色谱性能的方法参数用于方法转换. 将使用HPLC色谱柱的方法缩放为使用小粒径、短柱长色谱柱的方法，有效提高了USP方法的通量。 使用配备3.5 pm色谱柱的UHPLC系统和配备1.7 um色谱柱的UPLC系统进行分析时，富马酸喹硫平分析方法的运行时间分别缩短了57%和87%。 缩放方法至所用的色谱柱规格之后，方法的系统适应性参数仍满足USP各论对富马酸喹硫平分析方法的要求。 沃特世解决方案 Alliance"HPLC系统 ACQUITY"Arc系统ACQUITY UPLCH-Class PLUS系统 沃特世方法转换计算器 XBridge色谱柱Empower"3色谱数据软件 关键词 USP方法，色谱柱缩放，富马酸喹硫平，方法转换，扩散，延迟体积 简介 如今，运行药典色谱方法的分析人员越来越希望能找到可缩短分析时间并节省溶剂用量的等效分析方法。美国药典(USP)方法通常使用粒径>3 pm的高效液相色谱(HPLC)柱，这类方法需要采用较高流速，且运行时间较长。尽管USP方法规定了具体条件，但我们可将等度方法缩放为使用小粒径色谱柱的方法，从而缩短运行时间，减少溶剂消耗。USP通用章节<621>1中列出了可接受的色谱柱和方法调整，允许对等度方法进行缩放，以便获得更佳(或相当)的性能。允许做出的调整包括在保持L/dp比不变的前提下缩放粒径和色谱柱规格(其中L是色谱柱长度， dp是色谱柱填料的粒径)，此外还可调节流速，以及相应地调节进样体积。在缩放这类方法时，考虑延迟体积和柱外扩散对色谱分离的影响，以及考虑是否有必要选用低扩散、耐高压的系统(如UHPLC或UPLC系统)十分重要。 本研究使用沃特世方法转换计算器将富马酸喹硫平(一种抗精神病药物)的USP方法?缩放至粒径较小的色谱柱，然后在多种LC系统上运行缩放后的方法(包括Alliance HPLC系统、ACQUITY Arc UHPLC系统和ACQUITY UPLC H-ClassPLUS系统)。研究结果证明，方法缩放可改善方法性能、缩短运行时间和提高通量，而且缩放后的方法仍可达到USP各论针对富马酸喹硫平分析的系统适应性要求。 图1.富马酸喹硫平的结构。 实验 样品描述 两种参比标准品购自USP：喹硫平系统适应性标准品(目录号：1592715)；富马酸喹硫平标准品(目录号：1592704)。未知样品购自Alibaba.com。所有样品均使用流动相稀释至以下浓度：系统适应性溶液稀释至1.0 mg/mL，标准品溶液和样品溶液稀释至0.08mg/mL。 结果与讨论 首先采用USP各论中所述的色谱柱和详细方法条件在Alliance HPLC系统上运行富马酸喹硫平的原始USP分析方法。然后使用沃特世方法转换计算器(图2)，依据USP指南'的要求对色谱柱规格和方法条件进行缩放，随后在ACQUITY Arc UHPLC系统和ACQUITYUPLC H-Class PLUS系统上运行缩放后的方法。在确定运行方法的最佳条件时，应同时考虑色谱柱规格和LC系统特点。对于LC系统，延迟体积和柱外扩散是我们要考虑的两个关键属性。系统延迟体积是从溶剂混合点到混合溶剂进入色谱柱的入口处的体积。虽然延迟体积会对梯度方法产生显著影响，但对等度方法几乎没有影响响。因此，为运行等度方法的色谱柱确定最佳LC系统时，柱外扩散是主要考虑因素。使用小尺寸的色谱柱时，减少柱外扩散非常重要，因为柱外扩散会影响化合物的分离度、峰展宽和柱效5。因此，为了获得最佳性能，应最大限度减小柱外扩散与色谱柱体积之比。有关延迟体积和柱外扩散的详细信息，请参阅参考文献#5中所列的白皮书。 为了保持L/dp比不变，我们将色谱柱规格和粒径由原始色谱柱规格缩放为粒径3.5 pm的3.0 mm×150 mm色谱柱(图2)。由于该色谱柱的柱体积较小，为了与之相匹配，我们选择在扩散较低的ACQUITY Arc UHPLC系统上运行富马酸喹硫平分析。L/dp比率降低了14%，但仍在USP标准范围内(USP标准规定不得超过原始方法的-25%~+50%)。改变色谱柱的粒径和内径后，使用如下公式计算对应的流速： 其中，F，和F，分别是原始方法和缩放后方法的流速； dc，和dc，分别是原始方法和缩放后方法的色谱色内径； dp，和dp，分别是原始方法和缩放后方法的粒径'。本实验中，原始方法的流速为1.3 mL/min， 缩放至3.5 pm粒径色谱柱之后的流速降低至0.8 mL/min。 USP通用指南规定： “在方法精度、线性和检测限不超出可接受范围的前提下，可适当调整进样体积'。”在本研究中，沃特世方法转换计算器(图2)在缩放原始方法时，将进样体积从50pL减少为12.8pL。 图2.沃特世方法转换计算器界面，使用5 pm粒径色谱柱的原始USP药典方法(左)被缩放成为使用3.5 pm粒径色谱柱的方法(右)。 为了将富马酸喹硫平分析方法缩放至1.7 pm粒径色谱柱，我们再次使用了沃特世方法转换计算器(图3)。选用ACQUITY UPLC H-ClassPLUS系统配合2.1mm×75mm色谱柱进行富马酸喹硫平分析，目的是减少柱外扩散(Alliance HPLC系统和ACQUITY Arc UHPLC系统有较为明显的柱外扩散)。缩放色谱柱规格后， L/dp比率降低了12%，但仍在USP标准范围内(USP标准规定不得超过原始方法的-25%~+50%)。原始方法缩放至1.7 pm粒径色谱柱之后，流速从1.3mL/min降低至0.8 mL/min， 进样体积从50pL降至3.1pL。我们没有采用方法转换计算器给出的流速0.8 mL/min(图3)，这是由于ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统在该流速下已超出其15，000 psi的压力上限。本实验采用0.5 mL/min作为最终流速，因为系统在该流速下的最大压力为14，000 psi。依据通用章节<621>针对USP方法条件的规定，这种流速调整是可接受的，根据规定，如果基于色谱柱规格调整了流速，则还可在原始流速±50%范围内进一步调整'。 图3.沃特世方法转换计算器界面，使用5 um粒径色谱柱的原始USP药典方法(左)被缩放成为使用1.7 um粒径色谱柱的方法(右)。 所有样品均按照USP分析方法中规定的实验步骤配制而得，每种溶液进行六次重复进样。为了确定USP方法是否已成功缩放至合适的色谱系统，我们评估了富马酸喹硫平USP各论中列出的系统适应性参数。此外，分别在三个系统上分析未知样品以确定缩放后方法的重现性。 系统适应性测试是USP各论的一个重要组成部分，因为我们要据据确定“色谱系统的性能是否足以用于预期分析3”。USP各论针对系统适应性的要求如下：根据USP各论给出的相对保留时间进行峰鉴定，脱乙氧基喹硫平与喹硫平峰之间的分离度(图4)不得小于(NLT) 1.5。要求标准品溶液的拖尾因子不得大于(NMT)2.0，相对标准偏差(RSD)不得大于 2.0%。所有样品色谱图中的第一个峰均可归属为富马酸，在基于保留时间、峰面积和拖尾因子评估系统适应性时未考虑此峰，因为它不是主要的活性药物成分(API)。 在前述LC系统上运行富马酸喹流平的原始USP分析方法和缩放后方法以评估系统适应性。使用三种方法得到的示例色谱图见图4(系统适应性溶液)和图5(样品溶液)。所有方法分析系统适应性溶液和标准品溶液的结果均满足系统适应性要求，详细结果如表1所示。 图4.富马酸喹硫平系统适应性参比样品的分析结果对比：上图为使用Alliance HPLC系统和5 um粒径色谱柱运行原始方法得到的色谱图，中图和下图为原始方法缩放至3.5um粒径色谱柱和1.7 pm粒径色谱柱之后，分别在ACQUITY Arc UHPLC(中图)中ACQUITY UPLCH-Class PLUS系统(下图)上运行得到的色谱图。系统适应性溶液中含有饱和的API(喹硫平)，目的是获得足够高的杂质化合物灵敏度。化合物鉴定结果如下：峰1：富马酸；峰2：喹硫平相关化合物G；峰3：喹硫平相关化合物B；峰4：脱乙氧基喹硫平峰；峰5：喹硫平。 图5.样品溶液的分析结果对比：：上图为使用Alliance HPLC系统和5 pm粒径色谱柱运行原始方法得到的色谱图，，中图和下图为原始方法缩放至3.5 um粒径色谱柱和1.7 pm粒径色谱柱之后，分别在ACQUITY Arc UHPLC系统(中图)和ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统(下图)上运行得到的色谱图。依据USP各论中给出的相对保留时间鉴定化合物。化合物鉴定结果如下：峰1：富马酸；峰5：喹硫平。 分离度 喹硫平峰面积 喹硫平保留时间 保留时间 每个样品 的溶剂消耗量 (mL) (峰4&5) 喹硫平拖尾 &RSD %RSD (min) Alliance HPLC 系统 2.4 1.2 0.09 0.16 15 19.5 ACQUITY Arc UHPLC系统 2.2 1.1 0.09 0.02 7 5.6 ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统 2.5 1.1 0.01 0.10 3 2.4 USP要求 NLT 1.5 系统 NMT 2.0 NMT 2.0% NMT2.0% N/A N/A 适应性溶液 标准品溶液 标准品溶液 标准品溶液 表1.采用USP富马酸喹硫平分析方法在Alliance HPLC系统、ACQUITY Arc UHPLC系统和ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统上分析系统适应性溶液和标准品溶液得到的结果、对应的USP要求，以及每种方法的运行时间和溶剂消耗量。 除了能达到与原始方法相当或更好的色谱性能外，将方法缩放至较小粒径的色谱柱可以显著缩短运行时间并减少溶剂消耗量。原始方法缩放至3.5 pm色谱柱之后，运行时间从15 min缩短至7 min， 溶剂用量减少了66%。将方法进一步缩放至1.7 pm色谱柱之后，运行时间从15 min缩短至约2min， 溶剂用量减少了将近90%。将USP方法缩放至较小粒径的色谱柱可以显著提高通量，同时降低每个样品的分析成本。 此外，我们还分析了未知样品中富马酸喹硫平的百分含量。使用标准品溶液和样品溶液的数据按如效公式计算百分含量： 其中，r是样品溶液的峰响应，r是标准品溶液的峰响应， C，是标准品溶液中USP富马酸喹硫平标准品的浓度(mg/mL)，C是样品溶液中富马酸喹硫平的浓度(mg/mL)。表2列出了使用不同方法得到的富马酸喹硫平含量(百分比)。这些值都不在USP可接受标准98.0%~102.0%范围内。如果这些样品是批次放行样品，则需要进一步检测，确定导致纯度结果值过高的原因。这可能需要进行峰纯度评估或运用正交检测技术(如质谱)进行分析。但是，由于本应用纪要的目的是证明等度方法的可扩展性，因此如上所述的进一步评估不在本研究的范围之内。 方法缩放的一个要点是保证原始方法和缩放后方法能够生成相同的结果。在不同LC系统上缩放USP喹硫平分析方法之后，分析未知样品时得到了一致的结果(表2)，这表明缩放后的方法能够生成可靠的数据。 样品结果(%) Alliance HPLC 系统 109.5 ACQUITY Arc UHPLC 系统 108.9 ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统 109.7 表2.在三种色谱条件下运行USP富马酸喹硫平分析方法得到的样品溶液中富马酸喹硫平的含量百分比，所用色谱条件分别为：配备5pm粒径色谱柱的Alliance HPLC系统、配备3.5 pm粒径色谱柱的ACQUITY Arc UHPLC系统，以及配备1.7 um粒径色谱柱的ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统。 结论 依据USP通用章节<621>1中的方法缩放指南，可将传统等度HPLC方法缩放为采用粒径较小、柱长较短的色谱柱。缩放后的USP方法可采用先进填料和LC仪器，从而有效提高通量，减少溶剂消耗量，同时提供准确且可重现的色谱数据。富马酸喹硫平的原始USP分析方法被缩放为采用ACQUITY Arc UHPLC系统和3 pm色谱柱之后，运行时间缩短了57%，缩放为采用ACQUITYUPLCH-Class PLUS系统和1.7 pm色谱柱之后，运行时间缩短了87%。在分离度、 峰拖尾因子、保留时间和峰面积RSD方面，缩放后方法的色谱性能与原始方法相当甚至优于原始方法。 ( 参考文献 ) ( 1. Chapter <621> Chromatography. United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 40-NF35 S1) Baltimore， MD： United Book Press， Inc.； 2017. ) ( 2. O ( fficial Monographs， Quetiapine Fumarate USP 40NF35 S1， United States Pharmacopeia and NationalFormulary(USP40-NF35 S1) Baltimore， MD： United Book Press， I n c.； 2017. p.5939. ) ( 3. S $ nyder， Lloyd R.； Kirkland， Joseph； Dolan， John W. Introduction to Liquid Chromatography，3rd Edition. H o boken： Wiley and S o ns， 2 0 10. Pr i nt. ) ( 4. S nyder， Ll o yd R . ； Kirkland， Joseph； Dolan， John W. Introduction to Liquid Chromatography， 3rdEdition.H o boken： Wiley and Sons， 2010. Pri n t. p. 112 (dwell volume). ) 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特斯中国有限公司 ( 沃特世科技(上海)有限公司 ) THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 Waters、The Science of What's Possible、ACQUITY、UPLC、Alliance、Arc、Empower和XBridge是沃特世公司的商标。其听所有商标均归各自的拥有者所有。 香港：852-29641800 ( 免费售后服 务 热线：800(400)820 2676 www.waters.com ) 富马酸喹硫平的USP分析方法在不同液相色谱系统上的方法转换 本研究使用沃特世方法转换计算器将富马酸喹硫平(一种抗精神病药物)的USP方法缩放至粒径较小的色谱柱，然后在多种LC系统上运行缩放后的方法(包括Alliance HPLC系统、ACQUITY Arc UHPLC系统和ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统)。研究结果证明，方法缩放可改善方法性能、缩短运行时间和提高通量，而且缩放后的方法仍可达到USP各论针对富马酸喹硫平分析的系统适应性要求。