单克隆抗体中SEC分析方法转换检测方案(液相色谱仪)

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[应用纪要]THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要1 ■ Waters Brooke M. Koshel和Sean M. McCarthy， 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用优势 利用ArcIMMulti-flow path"技术模拟HPLC或UHPLC分离 实现SEC-HPLC方法从Agilent 1100系统到ACQUITY@ Arc系统的无缝转移 将HPLC方法升级为UHPLC方法，提高工作效率 XBridge 蛋白分析专用柱 Empower@3色谱数据软件(CDS) 关键词 简介 体积排阻色谱(SEC)是制药行业分析单克隆抗体等生物治疗药物的常用技术。SEC的应用贯穿整个产品生命周期从药物发现到商业化。在产品的生命周期中，分析方法常常需要转换至同一机构的各个实验室，或转换至各个合同组织，因此法规指南要求实验室间的方法转换过程必须验证方法的等效性，以确保产品质量和一致性。正如用于产品放行检测采用的所有分析方法一样，我们必须确保分析仪器稳定可靠且各实验室都能轻松部署。ACQUITY Arc系统是一款可以填补HPLC与UPLC@之间的性能差距的LC平台，它能够让用户在各实验室之间实现无缝的方法转换。借助Arc Multi-flow path技术，用户可以轻松重现传统HPLC分析方法以及应用UHPLC方法'。 本研究采用单克隆抗体评估了从Agilent 1100系列仪器到ACQUITY Arc系统的SEC方法转换，将峰面积和保留时间作为评估指标验证各平台之间的等效性，并且评估了ACQUITY Arc系统的系统重复性。最后，我们还将验证方法转换所用的HPLC方法提升为UHPLC方法，， 从而获得更好的分离度和更快的分析速度。 ( 方法转换， ACQ U ITY Arc， S E C，单克隆抗体 ) LC条件 LC系统： 配备2489 UV/Vis检测器的ACQUITY Arc系统， 流路1 配备四元泵和DAD检测器的Agilent 1100 系列LC系统 吸收波长： 280 nm 采样速率： 20Hz 柱温： 30℃ 流动相： 0.02M磷酸钠，0.3M氯化钠， pH6.8 样品温度： 5℃ 进样体积： 30pL HPLC条件 HPLC色谱柱： Tosoh TSK gel G30000SW250 A， 5 um， 7.8mmx 300mm 流速： 0.5mL/min 方法用时： 35 min UHPLC条件 UHPLC色谱柱： XBridge BEH SEC蛋白分析专用柱，200A， 3.5 pm， 7.8 mmx 300 mm (部件号176003596) 流速： 0.714mL/min 方法用时： 24.5 min 数据管理 Empower 3 CDS软件， SR2 结果与讨论 传统SEC-HPLC方法Agilent 1100系列转换到ACQUITY Arc系统，获得了良好的等效性和高度重现性。 使用以流动相配制的1mg/mL的利妥昔单抗(一种单克隆抗体)，被用于HPLC方法转移的研究，从Agilent1100系列仪器到ACQUITY Arc系统的方法转移。本研究所用的SEC方法摘自USP药物标准集?，尽管该标准集现已停用，但这种方法仍然是制药行业进行典型SEC分析的代表性方法。首先，我们在Agilent 1100系列仪器上使用Tosoh SEC色谱柱分离利妥昔单抗，创建了基准色谱图(图1A)，然后将该方法转换到ACQUITY Arc系统，在相同的方法条件下采用流路1运行(图1B)。两种色谱图显示出了极大的相似性。 保留时间和峰面积百分比的评估结果(表1)确证了这一结论。不同仪器之间保留时间的变化约为0.2 min，而更重要的是，峰面积百分比没有发生改变。 图1.SEC采集数据比较使用A) Agilent 1100系列和B)ACQUITY Arc系统。插图显示了从单体主峰分离出的二聚体组分峰和高分子量组分峰。 随着行业标准对产品一致性的要求日趋严格以及对方法适应性的需求不断增加，仪器的重现性显得愈发重要。图2所示为采用上述方法参数在ACQUITY Arc系统上进行5次进样的叠加谱图，各谱图之间几乎已经无法相互区分。表2提供了该数据的定量分析结果，包括2个系统的保留时间、峰面积百分比和分离度的结果。 将SEC-HPLC升级至SEC-UHPLC可提高分离度并缩短运行时间 ACQUITY Arc系统允许用户在单一平台上兼容HPLC和UHPLC运行条件。为了充分利用该优势，本研究将Tosoh SEC色谱柱更换为XBridge BEH SEC蛋白分析专用柱。由于色谱柱粒度减小，我们需要对其它方法参数进行适当调整。由于色谱柱规格不变，根据以下的方程，新的流速F应与粒径成反比： 其中F，表示之前的流速， d，和d，分别表示之前的和现在的色谱柱内径， dp，和dp，分别表示之前的和现在的粒度。利用以上方程式，可计算出新的流速应为0.714 mL/min。根据以下方程式，可利用调整后的流速确定新的运行时间t： 其中t，表示之前的运行时间， L，和L，分别表示之前的和现在的柱长。经计算得出调整后的运行时间为24.5 min。这些新的方法条件满足USP许可的方法调整指南3，而遵循该指南更新的SEC方法无需重新进行方法验证。 系统 保留时间(min) 峰面积(%) HMW峰 二聚体 单体 高聚体 单体 Agilent 1100 系列 13.66 15.06 16.69 1.28 98.63 ACQUITY Arc 系统 13.49 14.87 16.47 1.29 98.65 0.17 0.19 0.22 0.01 -0.02 表1. Agilent 1100系列与ACQUITY Arc系统的HPLC-SEC分析结果比较。请注意，高聚体包括早于单体洗脱的所有峰(包括图1和图2中所示的二聚体峰和HMW峰)。所有结果都是5次进样的平均值。 图2.在ACQUITY Arc系统上进行5次进样获得的SEC叠加色谱图。插图显示了从单体主峰分离出的二聚体组分峰和HMW组分峰。 系统 相对峰面积(%) 分离度(二聚体-单体) 高聚体 单体 %RSD %RSD %RSD Agilent 1100系列 1.28 0.01 1.04 98.63 0.01 0.01 1.52 0.06 3.92 ACQUITY Arc 系统(HPLC) 1.29 0.01 1.04 98.65 0.01 0.01 1.54 0.03 1.64 ACQUITY Arc系统(UHPLC) 1.29 0.02 1.49 98.63 0.02 0.02 1.75 0.02 1.26 表2.在Agilent 1100系列仪器井进行HPLC-SEC分析以及在ACQUITYArc系统上分别采用HPLC和UHPLC条件进行SEC分析所得结果的定量比较。请注意，高聚体包括早于单体洗脱的所有峰(包括图1和图2中所示的二聚体峰和HMW峰)。所有结果都是5次进样的平均值。 我们在UHPLC条件下分离了利妥昔单抗，并将结果与HPLC分析结果进行比较。比较HPLC数据(图3A)与UHPLC数据(图3B)可以看出，在UHPLC分离中，二聚体峰和主峰之间的分离度有所提高。UHPLC条件得到的峰形更尖锐，洗脱时间也更早。尽管UHPLC条件可改善分离度，但两种方法所得的高聚体和单体峰的相对峰面积百分比却没有变化。这表明利妥昔单抗与固定相之间基本没有发生相互作用，这正是理想SEC分离的特征。表2比较了UHPLC结果与之前在两种系统下分析得到的HPLC结果。 图3.ACQUITY Arc系统采集SEC数据比较A) HPLC条件， B)UHPLC条件。与HPLC方法相比，UHPLC方法可以得到更窄的形形，更好的分离度更高，及更快央洗脱时间。 ( 结论 ) ACQUITY Arc系统的问世既满足了用户模拟传统HPLC技术的需求， 又提供根据用户需要应用UHPLC技术的优势。本研究成功将SEC方法从Agilent 1100系列HPLC转换到了 ACQUITY Arc系统， 无需更改任何方法参数。 ACQUITY Arc系统显示出了极高的重现性，这对于验证产品一致性极为重要。最后，实验结果还表明，从SEC-HPLC到SEC-UHPLC的方法转换可改善分离度、缩短运行时间，同时保持与HPLC条件相当的峰面积百分比。 ( 参考文献 ) ( 1. A 刷 CQUITY Arc System Brochure. Waters Brochure. 2015 ( P /N720005393EN) . ) 2.UL.S. Pharmacopeial Convention (accessed March 2015). 3.5.1U.S. Pharmacopeial Convention， General Chapter<621>Chromatography，USP38-NF33. Officialfrom August 1， 2015. 扫一扫，关注沃特世微信 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 上海：021-61562666 广州：020-2829 5999 Waters， The Science of What’s Possible， ACQUITY， XBridge， Empower和UPLC是沃特世公司的注册商标。Multi-flow path和Arc是沃特世公司的商标。其商所有商标均归各自的拥有者所有。 O2015年沃特世公司 中国印刷2015年9月720005510ZH AG-PDF 使用ACQUITY Arc系统进行HPLC到UHPLC的单克隆抗体SEC分析方法转换 使用ACQUITY Arc系统进行HPLC到UHPLC的单克隆抗体SEC分析方法转换 简介：体积排阻色谱(SEC)是制药行业分析单克隆抗体等生物治疗药物的常用技术。SEC的应用贯穿整个产品生命周期从药物发现到商业化。在产品的生命周期中，分析方法常常需要转换至同一机构的各个实验室，或转换至各个合同组织，因此法规指南要求实验室间的方法转换过程必须验证方法的等效性，以确保产品质量和一致性。正如用于产品放行检测采用的所有分析方法一样，我们必须确保分析仪器稳定可靠且各实验室都能轻松部署。ACQUITY Arc系统是一款可以填补HPLC与UPLC®之间的性能差距的LC平台，它能够让用户在各实验室之间实现无缝的方法转换。借助Arc Multi-flow path技术，用户可以轻松重现传统HPLC分析方法以及应用UHPLC方法1。本研究采用单克隆抗体评估了从Agilent 1100系列仪器到ACQUITY Arc系统的SEC方法转换，将峰面积和保留时间作为评估指标验证各平台之间的等效性，并且评估了ACQUITY Arc系统的系统重复性。最后，我们还将验证方法转换所用的HPLC方法提升为UHPLC方法，从而获得更好的分离度和更快的分析速度。应用优势：1）利用Arc™ Multi-flow path™技术模拟HPLC或UHPLC分离2）实现SEC-HPLC方法从Agilent 1100系统到ACQUITY® Arc系统的无缝转移3）将HPLC方法升级为UHPLC方法，提高工作效率结论ACQUITY Arc系统的问世既满足了用户模拟传统HPLC技术的需求，又提供根据用户需要应用UHPLC技术的优势。本研究成功将SEC方法从Agilent 1100系列HPLC转换到了ACQUITY Arc系统，无需更改任何方法参数。ACQUITY Arc系统显示出了极高的重现性，这对于验证产品一致性极为重要。最后，实验结果还表明，从SEC-HPLC到SEC-UHPLC的方法转换可改善分离度、缩短运行时间，同时保持与HPLC条件相当的峰面积百分比。