20种氨基酸中UPLC-MS分析检测方案(液相色谱仪)

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[应用纪要]WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要] 在生物医学研究中使用Kairos氨基酸试剂盒对20种氨基酸进行UPLC-MS分析 Padhraic Rossiter'、Jaime Salcedo Dominguez'、Norma Breen'、Lisa Calton² 应用优势 色谱方法具有出色的分析选择性，可以分离同分异构体 分析运行时间短(<10 min) 峰检测的可信度高 灵活性更高，系系统可用于其它分析 沃特世解决方案 Kairos氨基酸试剂盒 AccQ-Tag"Ultra"3x"衍生化试剂盒 CORTECSUPLC C18， 1.6 um 2.1×150 mm 色谱柱 ACQUITY"UPLC H-Class系统 ACQUITY QDa质谱检测器 MassLynx"质谱软件 TargetLynx"应用管理软件 关键词 Kairos氨基酸试剂盒，氨基酸， ACQUITYQDa， AccQ·Tag Ultra 简介 Kairos氨基酸试剂盒(部件号：：1176004379，仅供研究使用)设计使生物医学研究人员能够在10分钟内完成对多达45种生物相关氨基酸的分析。已在适用情况下使用更高级参比物质为试剂盒校准品进行赋值，从而提高分析结果的可信度。Kairos氨基酸试剂盒校准品(部件号：：186009048)中9种氨基酸的量值可溯源至日本国家计量院(NMIJ CRM 6011a-6018a，6022a)，另外8种可溯源至美国国家标准技术研究所(NIST SRM 2389a)，其余氨基酸使用购自Sigma-Aldrich的TraceCERT标准品通过重量法制得。 本文将介绍使用Kairos氨基酸试剂盒对溶液中的20种氨基酸进行分析。使用配备CORTECS UPLC C18 1.6 um，2.1×150mm色谱柱(部件号：186007096)的ACQUITY UPLC H-Class系统进行色谱分离，然后使用ACQUITYQDa质谱检测器进行检测，该检测器经过专门设计，具有自动化设置功能，简便易用(图1)。利用样品溶液对试剂盒和分析系统的性能进行评估，并出于生物医学研究目的，对NIST SRM 2389a物质进行分析。 图1.Waters ACQUITYUPLC H-Class/ACQUITYQDa质谱检测器联用系统 试剂盒 Kairos氨基酸试剂盒(部件号： ：1176004379) LC条件 系统： ACQUITY UPLC H-Class柱温箱(CH-A) 进样针： 15uL 色谱柱： CORTECS UPLC C18 2.1× 150 mm， 1.6 pm (部件号：186007096) 保护柱： ACQUITY UPLC色谱柱在线过滤器套件 (部件号：205000343) 流动相A： 0.1%甲酸的水溶液 流动相B： 0.1%甲酸的乙腈溶液 洗针液： 流动相B 清除溶剂： 流动相A 柱温： 55°℃ 进样体积： 2pL 流速： 0.5 mL/min 梯度： 见表1 运行时间： 9 min MS条件 系统： ACQUITY QDa质谱检测器 采集模式： 单离子扫描(SIR)(详见表2和表3) 极性： ESI+ 毛细管电压： 0.8kV 离子源温度： 120°℃ 脱溶剂气温度： 600℃ 锥孔电压： 10V 数据管理 带TargetLynx应用管理软件的MassLynx软件4.1版 试剂盒复溶 复溶冻干的Kairos氨基酸试剂盒时，请按照维护和使用手册(720006448EN)进行操作。用2 mL 0.1M HCI复溶校准品和QC样品，在室温下混合至少30 min，确保所有物质完全溶解。用2mL水复溶内标，在室温下混合10 min， 确保所有物质完全溶解。将样品瓶内容物转移至容量瓶中，使用试剂盒中提供的10%磺基水杨酸将其定容至10mL。 试剂制备 制备Kairos氨基酸试剂盒试剂、硼酸盐缓冲液和AccQ·TagUltra"3X"衍生化试剂盒试剂时，请按照维护和使用手册(Z20006448EN)进行操作。硼酸盐缓冲液制备：将430uL 0.5MNaOH水溶液加入衍生化试剂盒中提供的6mL硼酸盐缓冲液中(试剂1)。有效期：3个月。储存条件：室温。AccQ·Tag Ultra"3X"试剂：用1.5mL乙腈(试剂2A)复溶AccQ·TagUltra"3X"(试剂2B)。在55℃下加热10 min并涡旋混合。有效期：5天。储存条件：室温。AccQ·Tag Ultra"3X"复溶后，应储存在干燥器内。 样品制备 第1步 向1.5 mLEppendorf管中加入50pL样品 第2步 加入50uL内标 第3步 涡旋混合5s 第4步 加入50uL水 第5步 涡旋混合5s 第6步 仅适用于高浓度样品-加入1000uL稀释剂(0.1M HCI)第7步 在9000g下离心15 min 第8步 向最大回收样品瓶中加入70pL硼酸盐缓冲液 第9步 向硼酸盐缓冲液中加入10uL上清液并移取混合液 第10步 加入20 pL AccQ·Tag Ultra"3X"试剂 第11步 涡旋混合5s 第12步 在室温下静置样品1 min 第13步 在55℃下加热10 min 第14步 进样2 uL 在精密度和准确度研究中，用0.1MHCI通过重量法为所有氨基酸制得浓度为20、150、400和700uM的样品组合，并另外为丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺制得浓度为2500pM的高浓度样品组合。 方法条件 时间 (min) %A %B 曲线 初始 99 1 初始 1 99 1 6 2 87 13 6 5.5 85 15 6 6.5 5 95 6 7.5 5 95 6 7.6 99 1 6 表1.用于分离氨基酸的梯度表 表2.氨基酸的SIR参数与校准品浓度范围 分析物 SIR (m/z) 校准范围(uM) 丙氨酸 260.2 5-4000 甘氨酸 246.2 5-4000 异亮氨酸 302.2 5-4000 亮氨酸 302.2 5-4000 苯丙氨酸 346.2 5-4000 缬氨酸 288.2 5-4000 苏氨酸 290.2 5-4000 丝氨酸 276.2 5-4000 酪氨酸 352.2 5-4000 谷氨酰胺 317.2 5-4000 精氨酸 345.2 5-1000 赖氨酸 244.1 5-1000 脯氨酸 286.2 5-1000 天冬氨酸 304.2 5-1000 胱氨酸 291.1 2.5-500 谷氨酸 318.2 5-1000 组氨酸 326.2 5-1000 蛋氨酸 320.2 5-1000 色氨酸 375.2 5-1000 天冬酰胺 303.2 5-1000 表3.内标的SIR参数 分析物 SIR(m/z) 丙氨酸C3N 264.2 甘氨酸C2N 249.2 异亮氨酸1c。15N 309.2 亮氨酸1c15N 309.2 苯丙氨酸CgN 346.2 缬氨酸1c15N 294.2 苏氨酸c15N 295.2 丝氨酸C3N 280.2 酪氨酸CgN 362.2 谷氨酰安C5N 324.2 精氨酸c15N4 355.2 赖氨酸c6N2 248.1 氨酸cs15N 292.2 天冬氨酸c415N 309.2 胱氨酸 c。N2 295.1 谷氨酸cs15N 324.2 组氨酸CN3 335.2 蛋氨酸C5N 326.2 色氨酸c1N2 388.2 309.2 结果与讨论 分析高浓度样品之后，在后续的空白进样中未观察到明显的系统残留污染(校准品1的检测器响应≤20%)。 在三天内连续配制样品组合并重复分析五次(n=15)来测定精密度，计算每组样品的日内和日间精密度(%CV)。每组样品的日内精密度≤12.0%CV，日间精密度≤14.7%CV，平均日和和日间精密度≤11.3%CV， 如表4所示。 为评估线性，在三天内每天对Kairos氨基酸试剂盒校准品进行分析。回归分析的结果表明，对于所分析的20种氨基酸，在考察的浓度范围内使用1/x加权均实现了线性拟合(表5)。各氨基酸的确定系数(r)均大于0.99，其中校准品的反算浓度处于标示值±15%的范围内(在LLOQ的浓度下除外，其反算浓度处于标示值±20%的范围内)。至少75%的校准品满足这一标准。 表4.溶液中20种氨基酸的平均日内和日间分析精密度 分析物 日内精密度 日间精密度 (%CV) (%CV) 丙氨酸 6.0 6.1 甘氨酸 4.9 7.2 异亮氨酸 1.4 2.0 亮氨酸 1.6 1.9 苯丙氨酸 2.2 2.5 缬氨酸 2.1 2.8 精氨酸 8.1 9.3 赖氨酸 4.3 6.1 氨酸 3.7 4.9 丝氨酸 6.6 7.9 苏氨酸 5.8 7.1 酪氨酸 2.6 3.2 天冬氨酸 7.4 8.5 胱氨酸 5.5 7.7 谷氨酸 5.5 6.1 组氨酸 5.6 6.9 蛋氨酸 2.5 2.8 天冬酰胺 9.1 11.3 色氨酸 1.7 2.0 谷氨酰胺 7.1 9.9 在一天内对用0.1M HCI制得的浓度范围为1-20 pM的样品重复分析五次进行灵敏度评估。在分析物峰的信噪比≥10：1且重复分析的精密度≤20%CV的情况下，测定每种分析物的LOQ。分析的所有20种氨基酸的LOQ均≤4pM，如表6所示。 表6.溶液中Kairos氨基酸试剂盒的灵敏度 通过分析单独制备的样品以及NIST SRM 2389a(开始分析前，采用重量法将浓度稀释至400pM)进行准确度评估。所有样品的浓度偏差均≤±12.3%(范围为-10.2~+12.3%)， 且NIST SRM 2389a稀释后浓度计算值的浓度偏差≤±8.9%(范围为-8.9~+6.2%)，如表7所示。 分析物 LOQ 精密度 准确度 信噪比 (M) (%CV) (%偏差) 丙氨酸 4 4.0 17.5 301 甘氨酸 3 6.8 19.3 177 异亮氨酸 1 0.0 20.0 31 亮氨酸 1 3.8 18.0 33 苯丙氨酸 2 2.4 12.0 109 缬氨酸 1 5.3 4.0 62 精氨酸 3 9.0 18.7 24 赖氨酸 3 2.9 16.7 223 脯氨酸 3 1.6 15.3 153 丝氨酸 4 8.0 19.5 69 苏氨酸 4 4.1 18.0 125 酪氨酸 2 0.0 10.0 137 天冬氨酸 4 3.2 19.0 97 胱氨酸 1.5 5.1 16.0 37 谷氨酸 2 5.2 19.0 100 组氨酸 2 9.6 14.0 11 蛋氨酸 1 5.2 6.0 91 天冬酰胺 1 5.8 6.0 25 色氨酸 3 1.6 15.3 152 谷氨酰胺 2 7.9 4.0 20 表7.溶液中Kairos氨基酸试剂盒的准确度 化合物 准确度汇总(%偏差) 20pM 150pM 400pM 700pM 2500pM 平均值 NIST 400 pM 丙氨酸 -1.8 -5.0 -5.1 -5.3 -5.7 -4.6 -5.7 甘氨酸 -3.1 -0.1 -2.4 -2.2 -7.9 -3.2 -3.8 异亮氨酸 -1.9 -1.6 -1.5 -2.7 -3.1 -2.2 -0.7 亮氨酸 0.8 0.1 -0.7 -0.7 -1.6 -0.4 0.3 苯丙氨酸 -0.2 -2.3 -2.4 -4.6 -3.2 -2.6 -2.4 缬氨酸 0.2 -0.9 -1.3 -2.3 -2.0 -1.3 -0.5 精氨酸 4.0 8.4 7.1 9.4 N/A 7.2 6.2 赖氨酸 -0.4 -2.7 -1.7 -5.5 N/A -2.6 -5.0 脯氨酸 -3.4 -0.4 0.9 -0.7 N/A -0.9 -2.0 丝氨酸 -2.4 -6.2 -5.1 -10.2 -6.6 -6.1 -6.1 苏氨酸 1.8 2.4 5.6 1.5 -1.4 2.0 0.6 酪氨酸 1.8 1.0 1.9 0.3 0.4 1.1 2.0 天冬氨酸 3.1 1.3 4.1 1.8 N/A 2.6 -0.7 胱氨酸 -1.5 -7.7 -4.4 -2.2 N/A -4.0 -0.7 谷氨酸 2.6 7.3 6.4 1.3 N/A 4.4 -8.9 组氨酸 -3.0 -1.0 2.4 -0.2 N/A -0.4 -3.9 蛋氨酸 -2.8 -1.2 -1.1 -2.8 N/A -2.0 -2.6 天冬酰胺 5.0 2.2 2.5 -0.7 N/A 2.2 N/A 色氨酸 -2.3 -4.3 -4.0 -3.3 N/A -3.5 N/A 谷氨酰胺 12.0 12.3 12.1 8.1 11.3 11.1 N/A 结论 Kairos氨基酸试剂盒使生物医学研究人员能够通过一套灵活的试剂盒获得值得信赖的结果，利用这套试剂盒，他们能够在10分钟内使用ACQUITY UPLC/ACQUITY QDa联用系统对处于正常生理浓度范围内的20种氨基酸进行准确定量。 采用AccQ·Tag Ultra"3X"衍生化试剂盒对样品进行衍生化，，可通过简单、稳定且快速的反相UPLC方法分析氨基酸，无需使用流动相缓冲液或离子对试剂。这意味着无需专用系统，因此ACQUITY UPLC/ACQUITY QDa联用系统还可以用于其它分析。衍生化样品具有良好的稳定性，并且在所用的色谱条件下，研究人员在10分钟内即可分离氨基酸异构体，并提供可靠的峰鉴定结果。 Kairos氨基酸试剂盒(仅供研究使用)中所述的方法使研究人员能够使用ACQUITY UPLC/ACQUITY QDa联用系统对溶液中的20种氨基酸进行分析，并获得良好的精密度、线性、灵敏度和准确度。 仅供研究使用。不适用于诊断。 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 扫一扫，关注沃特世微信沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)8202676 在生物医学研究中使用Kairos氨基酸试剂盒对氨基酸进行UPLC-MS分析 简介 Kairos氨基酸试剂盒（部件号：176004379，仅供研究使用）设计使生物医学研究人员能够在10分钟内完成对多达45种生物相关氨基酸的分析。已在适用 情况下使用更高级参比物质为试剂盒校准品进行赋值，从而提高分析结果的可信度。Kairos氨基酸试剂盒校准品（部件号：186009048）中9种氨基酸的量值可溯源至日本国家计量院（NMIJ CRM 6011a-6018a，6022a），另外8种 可溯源至美国国家标准技术研究所(NIST SRM 2389a)，其余氨基酸使用购自 Sigma-Aldrich的TraceCERT标准品通过重量法制得。本文将介绍使用Kairos氨基酸试剂盒对溶液中的20种氨基酸进行分析。使用 配备CORTECS UPLC C18 1.6 µm, 2.1 × 150 mm色谱柱（部件号：186007096）的ACQUITY UPLC H-Class系统进行色谱分离，然后使用ACQUITY QDa质谱检测器进行检测，该检测器经过专门设计，具有自动化设置功能，简便易用。利用样品溶液对试剂盒和分析系统的性能进行评估，并出于生物医学研究目的，对NIST SRM2389a物质进行分析。