饲料中氨基酸含量检测方案(二手分析仪器)

智能文字提取功能测试中

岛津应用数据集液相分析 LC-20A 柱前衍生化分析饲料中氨基酸含量(异硫氰酸苯酯法) 摘要：本文使用岛津LC-20A液相色谱仪建立了柱前衍生法检测饲料中的氨基酸方法。该方法以异硫氰酸苯酯为柱前衍生剂，使用C18柱，10mM磷酸缓冲液(pH=6.9)和乙腈为流动相，紫外检测器检测波长254 nm。六点外标法绘制工作曲线，各氨基酸标准曲线的线性相关系数均在0.9985以上，各氨基酸检测限均在1.200 umol/L以下；定量限均在3.999pmol/L以下。保留时间的RSD%在0.06%-0.40%之间，峰面积的RSD%在0.33%-1.19%之间，结果的重复性良好。15种氨基酸分离度良好， 0.5 umol/mL标准溶液的15种氨基酸的分离度在1.0以上。使用此法检测了四种不同基质的饲料实际样品中15种游离氨基酸。 关键词：柱前衍生法氨基酸异硫氰酸苯酯法前言： 蛋白质是生命的基础，而动物对蛋白质的需求本质上是对氨基酸的需求，因此饲料中氨基酸的种类和含量是衡量其质量高低的一项重要指标。氨基酸的测定方法很多，国家标准对饲料中氨基酸测定采用柱后衍生、用茚三酮作为衍生剂试剂的离子交换色谱法。此法需专门的仪器，价格昂贵。随着HPLC技术的发展，用反相柱柱前衍生化法测定氨基酸取得了很大发展。本文使用异硫氰酸苯酯作为柱前衍生试剂，在岛津LC-20A系统上建立15种氨基酸检测方法(不包含在饲料前处理过程中，被破坏的含硫氨基酸)。衍生反应见图1，15种氨基酸在254nm下同时得到检测，总分析时间为55分钟。 0 图1.异硫氰酸苯酯衍生反应 1.实验部分 1.1试剂与仪器 试剂：乙腈， HPLC级；磷酸二氢钠、磷酸 氢二钠、异硫氰酸苯酯、三乙胺、正正烷、HCl为分析纯级；2.5 umol/mL 氨基酸标准品 (Sigma出品)。 仪器： Shimadzu Prominence LC-20A，包括：二元泵(LC-20AD×2)、脱气机 (DGU-20A3)、自动进样器(SIL-20AC)、柱温箱(CTO-20A)、紫外检测器(SPD-20A) 及 LC Solution 工作站。 1.2色谱条件 色谱柱： Inertsil ODS-4 column (3 um，4.6×250mm)；流动相：A：10mM磷酸缓冲液(pH=6.9)； B：乙腈；流速：1.0mL/min；洗脱方式：梯度洗脱(梯度见表1)；柱温：40℃；检测波长：254nm，进样量：5uL。 表1.梯度洗脱程序 33卯 使用0.1N的HCl作为稀释液，将2.5 umol/mL氨基酸标准溶液逐级稀释成0.025、0.05、0.125、0.25、0.5和1.25 umol/mL六个工作溶液，分别按照报告分析条件中所述的衍生条件进行柱前衍生，衍生完成后进样分析。 2.2饲料样品的处理 饲料及饲料原料样品前处理步骤按 GB/T18246-2000操作步骤进行。称取含蛋白7.5~25mg试样，准确至0.1mg， 于20 mL安瓶中，加入10.00 mL酸解剂，置液氮中冷冻，之后抽真空至7Pa封口。将水解管置于110±1℃恒温干燥箱中，水解22h。取水解后样品 200 pL， 40℃ N2流吹干除酸，以 0.1N 的 HCl复溶，按照报告分析条件中所述的衍生条件进行柱前衍生，衍生完成后进样分析。 2.3异硫氰酸苯酯衍生方法 200 pL 样品中加入100 mM异硫氰酸苯酯(乙腈溶液)100pL和1M三乙胺(乙腈溶液)100pL，室温下放置1小时。向反应液中加入400 pL正己烷，振荡。静置分层后取下层液，经0.45 um 针式滤器过滤后进样分析。 3.结果与讨论 3.1氨基酸标准溶液的标准曲线结果 图2是浓度为 0.5 umol/mL 的氨基酸标准溶液衍生后的色谱图，相关数据见表2。各氨基酸的校准曲线及方程如下所示。各组分的标准曲线线性关系良好，15种氨基酸标准曲线的线性相关系数在 0.9985以上。 mAJx100) 图2.氨基酸标准溶液的色谱图 ID AA Ret. Time Resolution LOQ (umol/L) LOD (umol/L) 1 Asp 5.196 3.031 0.909 2 Glu 6.110 3.852 3.390 1.017 3 14.810 2.873 3.999 1.200 4 15.788 3.365 3.722 1.117 5 17.020 4.815 3.032 0.909 6 Arg 18.385 5.955 2.950 0.885 7 Thi 18.802 1.756 3.233 0.970 8 Ala 19.411 2.477 3.106 0.932 9 19.913 2.092 2.621 0.786 10 24.746 1.691 2.520 0.756 11 25.866 1.207 2.667 0.800 12 Ile 29.244 1.030 2.407 0.722 13 Leu 29.580 1.377 2.532 0.760 Phe 31.432 1.037 2.494 0.748 Lys 33.475 1.908 1.239 0.372 Y=(4.863320e-007)X+(-0.002555943)，r=0.9999 Conc 图4.氨基酸标准溶液的6次重复分析结果 表3.氨基酸标准溶液的重复性考察(n=6) ID Name Retention Time Peak Area Average RSD% Average RSD% 1 Asp 5.192 0.417 943，951 0.739 2 Glu 6.102 0.323 903.854 0.742 3 Ser 14.776 0.131 1，063，852 0.627 4 Gly 15.757 0.122 1，086，305 0.862 5 His 17.002 0.086 1，108，188 0.564 6 Arg 18.374 0.059 1.100，297 0.845 7 Thr 18.794 0.072 1，069，724 1.188 8 Ala 19.396 0.073 1.099.594 0.330 9 Pro 19.903 0.064 1.241.169 0.662 10 24.758 0.065 1.265，243 0.564 11 25.859 0.057 1，234.543 0.454 12 Ile 29.228 0.111 1.303.032 0.787 13 Leu 29.565 0.114 1.439.791 1.529 14 Phe 31.434 0.079 1，294，996 0.788 15 Lys 33.472 0.17 4，156，021 1.068 3.3稳定性考察 为了进一步考察衍生方法的稳定性，同一份样品 24h内进行11次，重复测量的结果 表4.氨基酸饲料样品的稳定性考察(n=11) ID AA AreaRSD% ID AA AreaRSD% 1 Asp 1.169 9 Pro 1.980 2 Glu 1.870 10 Tyr 1.021 3 Ser 1.113 11 Val 0.653 4 Gly 0.769 12 Ile 1.627 5 His 2.414 13 Leu 3.208 6 Arg 1.929 14 Phe 3.248 7 Thr 3.298 15 Lys 0.723 8 Ala 0.385 峰面积的RSD%在0.39%-2.41%之间，因此方法学建议，为保证数据准确性，所有样品应在衍生化结束24h 内全部测定完毕，或临测定前进行衍生化。 3.4饲料样品的分析结果 饲料中氨基酸含量的检测结果如表5所示，十五种氨基酸均得到检测。 图5.饲料样品中氨基酸分析的色谱图 表5.饲料样品氨基酸含量的检测结果 ID AA Real Concentration(umol/mL) 1294 1295 1055 1153 Asp 1.58 2.53 1.69 2.47 2 Glu 2.80 3.76 3.21 4.39 3 Ser 1.25 1.35 1.14 1.60 4 6.48 1.77 1.86 3.55 5 0.44 0.48 0.41 0.65 6 Arg 1.58 1.16 0.96 1.39 7 Thr 1.30 1.06 0.95 1.88 8 Ala 3.13 1.44 1.39 4.95 9 Pro 2.80 1.47 1.47 1.97 10 0.64 0.68 0.53 1.29 11 1.51 1.35 1.07 2.79 12 lle 1.00 1.00 0.63 1.63 13 Leu 1.93 1.81 1.52 3.09 14 Phe 0.98 1.03 0.80 1.46 15 Lys 1.48 0.82 0.44 1.17 3.4讨论 本报告中使用 LC-20A液相色谱仪，异硫氰酸苯酯柱前衍生法同时检测了15种氨基酸的混合标准溶液，并成功地应用于饲料中氨基酸含量的分析。 本文使用岛津LC-20A液相色谱仪建立了柱前衍生法检测饲料中的氨基酸方法。六点外标法绘制工作曲线，各氨基酸标准曲线的线性相关系数均在0.9985以上，各氨基酸检测限均在1.200?μmol/L以下；定量限均在3.999μmol/L以下。保留时间的RSD%在0.06%-0.40%之间，峰面积的RSD%在0.33%-1.19%之间，结果的重复性良好。15种氨基酸分离度良好，0.5?μmol/mL标准溶液的15种氨基酸的分离度在1.0以上。使用此法检测了四种不同基质的饲料实际样品中15种游离氨基酸。试剂与仪器试剂：乙腈，HPLC级；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、异硫氰酸苯酯、三乙胺、正己烷、HCl为分析纯级；2.5?μmol/mL氨基酸标准品（Sigma出品）。？仪器：Shimadzu?Prominence?LC-20A，包括：二元泵（LC-20AD×2）、脱气机（DGU-20A3）、自动进样器（SIL-20AC）、柱温箱（CTO-20A）、紫外检测器（SPD-20A）及LC?Solution工作站。