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编号: RLC-SH-20110125 快速溶剂萃取(ASE)-高效液相色谱(HPLC)法分析检测黄连中4种活性成DIONEX分 检测项目 表小檗碱,黄连碱,巴马汀,小檗碱 仪器设备 ASE350 UltiMate3000: LPG-3000 WPS-3000 TCC-3000 VWD-3000 参考资料 2010版药典 方法开发 车金水 最终审核 叶明立 加速溶剂萃取技术(Accelerated Solvent Extraction, ASE) 是在较高的温度(50℃一200℃)和压力(1000)-一3000psi)下用溶剂萃取固体或半固体样品的样品前处理方法。ASE具有萃取速度快、溶剂用量少,选择性高等优点。目前, ASE广泛应用于环境、食品、药物、天然产物以及聚合物等领域,可用于萃取酸性、碱性和中性物质、有机氯和有机膦农药、氯代除草剂、多氯联苯类物质、二恶英、多氯二苯呋喃、总石油烃、脂肪酸、天然产物和中药中的活性成分等。本实验研究了ASE对中药黄连中4种活性成分的萃取效率,并和药典中的方法进行比较,拓宽了ASE在中药中活性成分萃取方向的应用。 1、材料与方法 标准品配制:取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,即得。 超声萃取(ASE) 样品处理方法:取黄连粉末约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇-盐酸(100:1)的混合溶液50mL,密塞,称定重量,超声 处理30min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,即得。 快速溶剂萃取 (ASE) 样品处理方法:取黄连粉末0.5g,精密称定,加入石英砂适量,混合均匀,转至底层垫有玻璃纤维过滤膜的萃取池(10mL)中,快速溶剂萃取后,定容至50mL,过0.45um滤膜,即得。 2、仪器条件 2.1 ASE条件: a.溶剂:水 b.温度:140℃ c.静态萃取时间: 5min d.预热时间: 7min e.循环次数:2次 f.吹扫体积:60% g.吹扫时间:90s h.压力:1500psi 2.2HPLC条件 a.色谱柱: Acclaim 120 C18,4.6×150mm,5 Hm(PN: 059148) b.流动相:乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(50:50)(每100mL中加十二烷基硫酸钠0.4g, 再以磷酸调节pH值为4.0) c. 色谱柱温度:30℃ d. 进样量:10uL d. VWD检测器波长:345nm 图1标准品和样品ASE提取物色谱图 表1表小檗碱,黄连碱,巴马汀,小檗碱的相对保留时间 待测成分 保留时间 相对保留时间 表小檗碱 12.16 0.71 黄连碱 13.05 0.78 巴马汀 15.44 0.91 小檗碱 16.57 1.00 3、、ASE 条件选择 3.1药典条件 使用药典中的有机溶剂甲醇对黄连中的活性成分进行ASE萃取,实验结果表明,当ASE的条件为100℃,静态萃取为5min,单次循环就能达到药典中推荐方法(使用甲醇:盐酸=100:1作为有机溶剂,超声萃取30min)的萃取率,表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱萃取率分别为1.10%、2.09%、2.00%和7.78%,70,33次萃取的RSD为2.7-7.0%。超声提取黄连中的表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱萃取率分别为::11.02%、1.97%、1.89%和7.48%,3次萃取的RSD为3.1-8.4%。两种萃取方式均能满足药典中的规定:表小檗碱不得少于0.8%、黄连碱不得少于1.6%、巴马汀不得少于1.5%和盐酸小檗碱不得少于5.5%。 图2 USE(溶剂甲醇:盐酸=100:1,超声萃取30min)和ASE(甲醇,100℃,静态萃取时间5min, 1次循环)色谱图比较 图3 USE(溶剂甲醇:盐酸=100:1,超声萃取30min)和ASE(甲醇,100℃,静态萃取时间5min,1次循环)比较(n=3) 3.2溶剂的选择 本实验选择了水,乙醇,80%乙醇/水,甲醇四种溶剂对黄连中的活性成分进行萃取,实验结果表明乙醇对黄连中的活性成分萃取率较其他3种溶剂小,对表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的萃取率分别仅为0.42%、0.45%、0.82%和2.96%。而水,80%乙醇/水,甲醇3中溶剂对黄连中的活性成分萃取率相近,分别接近1.18%、2.10%、2.36%和9.07%。故后续试验中以最为廉价的水作为萃取溶剂。 图4萃取溶剂的选择 3.3萃取温度的选择 本实验分别考察了80℃、100℃、120℃、140℃和160℃5个温度对黄连中的小檗碱萃取率的影响。实验结果表明,随着温度的升高,对黄连中的小檗碱的提取率随之升高,分别为7.68%、8.06%、9.09%、9.78%和10.4%。其中当温度升到160℃时, ASE萃取液过微孔膜稍有阻碍,液相色谱图中也出现了小杂质峰,但不干扰活性成分,但对表小檗碱及黄连碱的萃取效率下降。所以后续实验选择140℃作为萃取温度。 图5萃取温度的选择 3.4静态萃取时间及循环次数 本实验比较了静态萃取时间5min和10min(均为2次循环)之间的差别,发现静态萃取时间5min和10min对黄连中的活性物质的萃取效率接近,即说明5min作为静态萃取时间,足够将黄连中的活性成分提取完全。同时本实验还对不同循环次数进行了研究,同一个样品,单循环萃取3次,其中第一次的萃取量为三次总量的80%左右,第二次为15%左右,第三次仅为5%左右。为节约萃取时间及溶剂,本实验选择静态萃取时间5min,2次循环的ASE萃取条件。 图6不同循环次数比较 3.5方法的重复性 本实验对同一个样品ASE萃取了3次,对表小檗碱,黄连碱,巴马汀和小檗碱的平均萃取率分别为1.40%、2.39%、2.28%和9.08%, RSD为3.6-6.4%,,符合分析检测的要求。该方法比药典中超声提取萃取率分别高出了37.2%、5、21.7%、20.9%和21.3%;同时萃取时间也缩短了,快速溶剂萃取是一种值得在中药领域推广使用的萃取方法。 图73次ASE提取重现性实验色谱图 图8 USE和ASE对4种活性物质的提取率的比较 4、结果讨论 采用药典中推荐的有机溶剂甲醇作为 ASE 的萃取溶剂,在萃取温度100℃,静态萃取时间5min, 单次循环就能达到药典中超声提取的萃取率。其中 ASE 萃取法明显的缩短了萃取时间。 对 ASE 萃取条件进行优化,得到最佳的萃取条件为:水为萃取剂,140℃为萃取温度,静态萃取时间 5min, 2次循环。在最佳条件下, ASE 对黄连中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的提取率为1.40%、2.39%、2.28%和9.08%,,明显优于药典中超声提取的提取率。 采用药典中推荐的有机溶剂甲醇作为 ASE 的萃取溶剂,在萃取温度 100℃,静态萃取5min,单次循环就能达到药典中超声提取的萃取率。其中 ASE 萃取法明显的缩短了萃取时间。对 ASE 萃取条件进行优化,得到最佳的萃取条件为:水为萃取剂,140℃为萃取温度,静态萃取时间 5min,2 次循环。在最佳条件下,ASE 对黄连中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的提取率为 1.40%、2.39%、2.28%和 9.08%,明显优于药典中超声提取的提取率。
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赛默飞色谱与质谱为您提供《黄连中活性成分检测方案(快速溶剂萃取)》,该方案主要用于中药材和饮片中含量测定检测,参考标准《暂无》,《黄连中活性成分检测方案(快速溶剂萃取)》用到的仪器有赛默飞Dionex™ ASE™ 350快速溶剂萃取仪、赛默飞UltiMate 3000 基础自动系统液相色谱。
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