药物中聚山梨醇酯80检测方案(液相色谱仪)

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LAAN-A-LC-C033 ApplicationnNo.L486News用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2015年4月 ApplicationNews 高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography 使用预处理柱 Shim-pack MAYI-ODS 通过在线固相萃取测定 lgG水溶液中的聚山梨醇酯80(1) No.L486 Analysis of Polysorbate 80 in IgG Aqueous Solution by On-Line SPE Using Shim-pack MAYI Column (Part 1) 在药物检测中需要进行各种各样的分析。通过反相HPLC对含有高浓度高分子蛋白质样品进行分析时，如果使用普通的 ODS 色谱柱，会导致填充剂老化，因此需要事先进行除蛋白处理。 Shim-pack MAYI 系列产品用亲水性聚合物对齐充剂毛细孔外表进行涂层，并且种类繁多，可应对快速排出蛋白质的在线固相萃取方法。与色谱柱切换 HPLC联用，可自动进行除蛋白到分析的一系列操作，高效分析各种成分。 使用 MAYI 系列产品对血浆血清中的药物进行分析的示例已在应用报告 No.L285、286、293、305、307、315、327中介绍。如果将该系列产品用于生物样品分析系统“Co-Sense for BA”， 可进行更高灵敏度和高精度的测定。 为了防止蛋白质制剂发生蛋白质凝集和吸附，通常向制剂中添加表面活性剂聚山梨酯80，以提高溶解度。本文向您介绍聚山梨酯80的分析示例。 Shim-pack MAYI色谱柱 Principle of Shim-pack MAYI Column 图1为 Shim-pack MAYI 的填充剂结构。由图可知，亲水性聚合物有效排阻了高分子，使其无法进入毛细孔内，而低分子则被捕集到毛细孔内，保留在色谱柱中。 图1 Shim-pack MAYI色谱柱的除蛋白原理 Principle of Deproteinization Using Shim-pack MAYI Column 图2为使用预处理柱通过色谱柱切换 HPLC进行分析的流程图。由图可知，从自动进样器导入预处理柱的蛋白质穿过预处理柱直接被排出。 图2分析流程图 Flow Diagram 图3为用UV检测器(波长280nm)检测含 IgG的典型样品(后述)得到的色谱图。由图可知，蛋白质(IgG)得以迅速排出。 图3确认蛋白质从 Shim-pack MAYI 色谱柱排出 由于将聚山梨酯80萃取到预处理柱，因此本次分析使用了以C18(十八烷基)为填充剂并对毛细孔内部进行了涂层的 Shim-packMAYI-ODS。分析流程为：蛋白质排出(此处为1分钟)后切换阀，将样品从预处理柱导入分析柱，并对流路进行清洗，以备下一次分析。 标准样品的分析 Analysis of Standard Solution 图4为聚山梨酯80(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)的结构式。 图4聚山梨酯80的结构式 Typical Structure of Polysorbate 80 因为聚山梨酯的紫外吸收较弱，所以本次分析使用了质谱仪。表2为分析条件。图5为标准样品(100ug/mL)的总离子流色谱图(TIC)。通常，聚山梨酯含有多种副产物，有的副产物保留时间长，因此使用异丙醇作为流动相。 表2分析条件 图5聚山梨酯 80 100 ug/mL标准品的总离子流色谱图(TIC)TIC Chromatogram of 100 ug/mL Polysorbate 80 Standard 图6为保留时间约4.4分钟的质谱图。由于含有不同聚合度的聚氧乙烯，因此得到了大量的峰。本次对含25个聚氧乙烯的聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯中附加2个铵离子的物质用SIM 进行了测定(图7)，监测离子为 m/z783. 图6图5中保留时间为4.4分钟的质谱 Mass Spectrum of the Peak at 4.4 min in Fig.5 图7聚山梨酯 80 100 pg/mL标准品的 SIM 色谱图 SIM Chromatogram of 100 ug/mL Polysorbate 80 Standard 由图可知，在10~200ug/mL 范围内的相关系数R在0.999以上，表示线性良好。因此以下测定继续使用本条件。 图8标准曲线(10~200g/mL)Linearity (10-200 ug/mL) ■典型抗体样品的分析 Analysis of Antibody Model Sample 向含有20 mg/mL IgG 的 10 mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.8)溶液中添加聚山梨酯80，使其浓度达到 100 ug/mL，然后注入到 HPLC系统进行分析。通过在线自动除蛋白处理，由图可知，回收率为99%、保留时间为 0.034%RSD、峰面积为1.11%RSD， 表示重复性良好。 图9典型抗体样品的SIM 色谱图 SIM Chromatogram of Antibody Model Sample ( 免责声明： ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) 在药物检测中，通过反相HPLC对含有高浓度蛋白质样品分析时，如果用普通ODS柱会导致填充剂老化。MAYI柱与生物样品分析系统Co-sense for BA一起使用，可进行更高灵敏度、高精度测定。为了防止蛋白质制剂发生蛋白质凝集和吸附，通常向制剂中添加表面活性剂聚山梨酯80，以提高溶解度。本文介绍聚山梨酯80分析示例。