疫苗 滴眼液中硫柳汞（乙基汞硫代水杨酸钠）含量检测方案(ICP-MS)

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SSL-CA19-076Excellence in Science Excellence in ScienceICPMS-109 http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline：021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai HPLC-ICP-MS测定疫苗等药品中抑菌剂硫柳汞含量 ICPMS-109 摘要：建立了高效液相色谱分离-电感耦合等离子体质谱谱(HPLC-ICP-MS) 联用测定疫苗和滴眼液等药品中抑菌剂硫柳汞的分析方法。样品经离心、去离子水稀释，以5%乙腈水溶液(含0.462%乙酸铵+0.12%L-半胱氨酸)为流动相， C18反向色谱柱分离，使用岛津 LC-20Ai 和ICPMS-2030 检测。在5~1000 ug/L(以硫柳汞计)范围内线性回归系数0.9999，硫柳汞仪器检出限(3S/N) 为1.20 pg/L。分别对疫苗和滴眼剂进行加标回收试验，加标回收率分别为116%和113%。该方法操作简便快捷，灵敏度高，准确性好，适用于疫苗、滴眼液等药品中抑菌剂硫柳汞含量的测定。 硫柳汞 (Thiomersal) 又名乙基汞硫代水杨酸钠，是一种含汞有机化合物。其分子式为C，H，HgNaO，S，汞含量为 49.551%，代谢产物为乙基汞和硫代水杨酸盐。其抑菌作用机理是汞离子与菌体中酶蛋白的巯基结合，使酶失去活性。 图1硫柳汞结构式 作为一种广谱抑菌剂，硫柳汞对疫苗抗原具有稳定作用，广泛应用于疫苗、毒素、抗病毒血清等医用产品中，包括大量接种的百白破疫苗、森林脑炎灭活疫苗等，含量要求不高于100 mg/L， 不同类别疫苗要求有一定差异。此外在注射剂、药用滴眼液中也会用到硫柳汞作为抑菌剂。 尽管世界卫生组织、美国医学研究院、美国儿科学会、英国药品安全委员会和欧洲药品评价局均强调，没有证据表明疫苗中硫柳汞的用量会对健康构成风险，但是由于含有毒有害的汞元素，引起公众对硫柳汞使用可能导致汞累积伤害身体的担忧。美国于2001年开始在儿童疫苗中不再使用硫柳汞作为抑菌剂，我国目前无停止使用硫柳汞的强制要求。 《中国药典》 (2015版)中疫苗硫柳汞的测定依据通则3115双硫腙滴定法和原子吸收分光光度法，滴眼液等按照通则0512使用液相色谱法测定。滴定法和原子吸收均需要对样品消解转化为无机汞，操作繁琐费时，液相色谱法灵敏度较低。 ICP-MS检出限低，与液相色谱联用可以实现快速高灵敏检测。 本文采用岛津高效液相色谱 LC-20Ai与电感耦合等离子体质谱仪 ICPMS-2030 联用分析疫苗、滴眼液等医用制品中抑菌剂硫柳汞的含量。 |实验部分 1.1仪器 岛津高效液相色谱仪 LC-20Ai；电感耦合等离子体质谱仪 ICPMS-2030；高速离心机。 1.2分析条件 表1液相色谱LC-20Ai 条件 参数 设定值 色谱柱 Intertsil ODS-SP (C18)5um， 4.6mm×150mm 流动相 A相：0.462%乙酸铵 +0.12%L-半胱氨酸；B相：乙腈 流速 1.5mL/min 柱温 35℃ 进样量 20 pL 洗脱程序 等度洗脱 (A： B=95：5) 表2ICPMS-2030条件 参数 设定值 参数 设定值 高频功率 1.20 kW 等离子体气流速 9.0 L/min 辅助气流速 1.10 L/min 载气流速 0.70 L/min 炬管类型 Mini 炬管 雾化器类型 同轴雾化器 雾化室 旋流雾室 雾化室温度 5°℃ 采样深度 5.0mm 高频频率 27.12 MHz |样品前处理 将样品8000rpm离心5min， 取适量上清液、去离子水稀释混匀， 0.22 um 滤膜过滤后待测。 l结果与讨论 3.1色谱分离图 对空白进行考察排除系统干扰，50 ug/L硫柳汞标准溶液色谱图见图2(单位 kcps)， 硫柳汞保留时间为2.67 min。 图2硫柳汞色谱图 3.2标准曲线和检出限 准确取取柳汞(100mg/L， 美国AccuStandard)标准溶液适量，以纯水逐步稀释为0、5、20、50、100、200、500、1000 ug/L(以硫柳汞计)系列浓度的标准溶液。 根据色谱及质谱分析条件，依次测定各标准点，，以硫柳汞浓度对峰面积做线性回归曲线，标准曲线如图3所示，在5~1000 ug/L范围内，线性相关系数0.9999。 图3硫柳汞标准曲线 (r=0.9999) 对浓度为5 ug/L 的硫柳汞溶液考察信噪比(见图4)，以三倍信噪比 (3S/N) 峰高对应浓度作为检出限，硫柳汞仪器检出限为1.20 ug/L。分别对 10 ug/L 和100 ug/L硫柳汞进行重复测定，结果见表3，相对标准偏差 (RSD) 为0.82%和0.56%，对高低浓度具有良好重复性。 图4浓度为 5 pg/L的硫柳汞色谱图 表3重复性测试结果 浓度(ug/L) 测定值(ug/L) RSD(%， n=6) 10.0 9.91 0.82% 100 103 0.56% 3.3样品测试结果 取市售疫苗和眼药水，按照前处理步骤处理后HPLC-ICP-MS分析，并进行加标回收试验。共测试9批次疫苗和3批次滴眼液样品，7批次疫苗和2批次滴眼液未检出。抑菌剂为硫柳汞的疫苗和滴眼液样品谱图和测定结果分别见图5和表4。如结果所示，疫苗测定结果小于中国药典中典柳汞限值100mg/L，眼药水结果为11.3 mg/L，与产品标识流柳汞浓度0.001%(10 mg/L)较一致，疫苗和眼药水加标回收率为116%和113%。 图5疫苗及滴眼液结果谱图 表4疫苗和滴眼液中硫柳汞测试结果及加标回收率 名称 测定值 稀释 结果 RSD 加标量 测定值 回收率 (ug/L) 倍数 (mg/L) (n=3) (ug/L) (ug/L) (%) 疫苗2017# 430 200 86.1 0.39% 200 663 116 疫苗2018# 441 200 88.2 0.45% SPAS 滴眼液 113 100 11.3 0.42% 200 339 113 ■结论 防腐剂(抑菌剂)是医用制品中必不可少的添加剂，可以有效防止细菌滋生、影响产品使用寿命，保障人体健康。硫柳汞是疫苗、滴眼液等药品中使用的抑菌剂之一，为了保证抑菌剂维持在合理的浓度范围，需要对其含量进行准确测定。本文建立了疫苗和滴眼液中硫柳汞测定的高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法(HPLC-ICPMS)。该方法检出限为1.2 ug/L，适用于疫苗等医用品中抑菌剂柳柳汞的测定，一定程度上可以弥补滴定法、原子吸收法等技术的不足。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心 Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 建立了高效液相色谱分离-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）联用测定疫苗和滴眼液等药品中抑菌剂硫柳汞的分析方法。样品经离心、去离子水稀释，以5%乙腈水溶液（含0.462%乙酸铵+0.12% L-半胱氨酸）为流动相，C18反向色谱柱分离，使用岛津LC-20Ai和ICPMS-2030检测。在5~1000 μg/L（以硫柳汞计）范围内线性回归系数0.9999，硫柳汞仪器检出限（3S/N）为1.20 μg/L。分别对疫苗和滴眼剂进行加标回收试验，加标回收率分别为116%和113%。该方法操作简便快捷，灵敏度高，准确性好，适用于疫苗、滴眼液等药品中抑菌剂硫柳汞含量的测定。