月饼中抗氧化剂、防腐剂和甜味剂检测方案(二手分析仪器)

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维普资讯 http：//www.cqvip.comnl693中国卫生检验杂志2005年6月第15卷第6期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology，Jun 2005；Vol 15 No6【测定方法】 月饼中常用抗氧化剂、防腐剂和甜味剂同时测定的方法研究 赵 榕，吴国华，薛 颖 (北京市疾病预防控制中心，北京 100013 [摘要] 目的：建立同时测定抗氧化剂、防腐剂和甜味剂的反相液相色谱方法。方法：以50 mmol/L 磷酸二氢钾溶液作为流动相，采用梯度洗脱。结果：可在30 min 内将11种组分完全分离并且测定。方法的线性范围：甜味剂0.5~150 pg/ml(r=0.9997~0.9999)；防腐剂和抗氧化剂1.0~300 pg/ml(r=0.9996~0.9999)，回收率：78.0%~106.7%，相对标准偏差为2.2%~12.7%，定性检出限：0.04~0.18 mg/kg，定量检出限：0.13~0.60 mg/kg。结论：建立了同时测定月饼中11种化合物的反相液相色谱法。 [关键词] 月饼；抗氧化剂；防腐剂；甜味剂；反相液相色谱 月饼是中国人喜爱的传统食品，多集中在高温、高湿的夏末秋初时节生产上市，易霉变、酸败。为了保证月饼的质量和风味，延长月饼的货架期，在月饼加工过程中经常加入抗氧化剂、甜味剂和防腐剂，而这些化合物对人体有一定的危害，因此对月饼中常用的抗氧化剂、防腐剂和甜味剂的监测十分必要。 目前测定抗氧化剂、甜味剂和防腐剂的方法主要有薄层色谱法、比色法2、气相色谱13和液相色谱法，而同时测定抗氧化剂、甜味剂和防腐剂的方法鲜有报道。为此我们对月饼中常见的7种抗氧化剂：丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、没食子酸辛酯(OG)、没食子酸月桂醇(LG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)；2种甜味剂：安赛蜜、糖精钠；2种防腐剂：苯甲酸、山梨酸这11种化合物的同时测定技术进行了研究。 材料与方法 1.1 仪器与试剂 1.1.1 仪器 Waters -2695 高效液相色谱仪，配备有 Waters-Allains2695 泵控系统，以及Waters -2996 二极管阵列检测器。 1.1.2 试剂 甲醇，色谱纯(迪马公司)；乙腈，色谱纯(迪马公司)；磷酸二氢钾，分析纯；苯甲酸、山梨酸、糖精钠丁基化羟基甲苯、没食子酸丙酯、丁基化羟基茴香醚、去甲二氢愈创木酸和安赛蜜的标准品购品 Fluka 公司；叔丁基对苯二酚标准品购自 Chem Service 公司；没食子酸月桂醇标准品购自 AcrosOrganics 公司；没食子酸辛酯标准品购自 Aldrich 公司；试验用水均为超纯水；高纯氮。 标准储备液的配制： 甜味剂标准储备液的配制：分别准确称取0.0100g安赛蜜、糖精钠标准品于 10 ml棕色容量瓶中，用20%(v/v)的甲醇水溶液溶解并定容。此溶液质量浓度为1.0 g/L。 防腐剂标准储备液的配制：分别准确称取0.0100 g苯甲酸、山梨酸标准品于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容。 ( [作者简介] 赵榕(1969-)，女，主管技师，主要从事食品污染物研究工作。 ) 此溶液质量浓度为1.0 g/L。 抗氧化剂标准储备液的配制：分别准确称取 0.0100g丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、没食子酸辛酯(OG)、没食子酸月桂醇(LG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)标准品于10 ml 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容。此溶液质量浓度为1.0 g/L。 混合标准液的配制：分别吸取安塞蜜、糖精钠标准储备液各0.25 ml，苯甲酸、山梨酸、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHA)、没食子酸丙酯(PG)、没食子酸辛酯(OG)、没食子酸月桂醇(LG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)的标准储备液各 0.5 ml，置于 10 ml棕色容量瓶中，用50%(v/v)的甲醇水溶液定容至体积。此溶液安塞蜜、糖精钠的质量浓度为 25 mg/L，苯甲酸、山梨酸、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、殳食子酸丙酯(PG)、没食子酸辛酯(OG)、没食子酸月桂醇(LG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)的质量浓度为50 mg/L。 标准系列的配制：配制安塞蜜、糖精钠质量浓度分别为0.5、2.5、5.0、10.0、25.0 mg/L， 苯甲酸、山梨酸、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、没食子酸辛酯(OG)、没食子酸月桂醇(LG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)的质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L的标准系列。 1.2 液相色谱条件 色谱柱： Waters - SymmetryShield RPig 5 um 3.9×150mm；流动相：A：50 mmoL/L 磷酸二氢钾，B：乙；波长：264 nm；柱温：40℃；进样体积：10pl. 1.3 样品处理 用旋风刨将月饼磨碎混匀，准确称取4.0 g于30ml离心管中，加入 10.0 ml 甲醇超声提取 40 min， 10 000 r/min 离心5 min，转移上清液；于残渣中加入10.0 ml 50%(v/v)甲醇水溶液第二次提取，离心后合并上清液。两次提取液充分混匀后，取1.0ml 于按1ml塑料离心管中， 1 000 r/min 离心10 min，上清液上机测定。 1.4 定性及定量 分别取标准系列和样品各10 p.l 进样，HPLC测定。以各组分标准的峰面积对各组分浓度做标准曲线。保留时间及扫描光谱图定性，外标法定量。 c=exl0，c一样品中待测组分的含量，mg/kg；c一待 分的测定浓度，ug/ml；W-样品重量，g 2 结果与讨论 2.1 HPLC 条件的优化 11种组分的极性差异很大，为了使各组分能够很好的分离，我们分别对流动相的 pH、盐浓度以及洗脱梯度等条件进行了优化。 在11种组分中，苯甲酸和山梨酸受 pH 值的影响较大，其保留时间随着流动相pH 值的加大而增加，而其他组分的保留时间受 pH值的影响较小。当流动相的 pH=5时，11种组分能够很好分离。 我们分别对 pH=5 的乙酸钠-乙酸和磷酸二氢钾两种体系进行了选择。由于乙酸钠-乙酸在测定波长230 nm有吸收，梯度洗脱时会造成基线漂移，因此，我们确定了磷酸二氢钾水溶液为流动相A液。 流动相中的盐可以抑制待测组分的解离，因此，我们对磷酸二氢钾的浓度进行了试验。当磷酸二氢钾的浓度为20 mmol/L 时，苯甲酸、山梨酸的峰形不对称；当磷酸二氢钾的浓度为 50 mmol/L 时，则可以有效的避免上述现象。 综上，我们确定了最佳色谱条件：流动相 A，50 mmol/L 磷酸二氢钾溶液；流动相B，乙腈；梯度洗脱(见图1、图2、表1)。 图1 标准色谱图 图2 样品加标色谱图 ASM，安赛蜜；TJN，糖精钠；BJS，苯甲酸；SLS，山梨酸；PG，没食子酸丙酯；NDGA，去甲二氢愈创木酸； TBHQ，叔丁基对苯二酚；BHA，丁基化羟基茴香醚；OG，没食子酸辛酯；LG，没食子酸月桂醇；BHT，丁基化羟基甲苯。 表1 洗脱梯度表 时间 流量(ml/min) 流动相A(%) 流动相B(%) 曲线 0 1.0 97 3 3 1.0 97 3 6 12 1.0 50 50 6 19 1.0 50 50 6 20 1.0 25 75 6 26 1.0 25 75 6 27 1.0 97 3 6 2.2 样品提取液的选择与优化 11种组分中，甜味剂易溶于水，较难溶于有机溶剂；脂溶性抗氧化剂较易溶于有机溶剂，较难溶于水；防腐剂既可溶于水，又可溶于有机溶剂。由于各种组分的化学性质差异很大，用一种提取液将11种组分同时提取难以做到。因此，我们对样品加标，分别对水、各种比例的甲醇水溶液以及纯甲醇的提取效率进行了实验，结果表明：甜味剂用50%甲醇水溶液提取，效率最高；而脂溶性抗氧化剂和防腐剂的提取效率，随着提取液中甲醇比例的增加而提高，当使用纯甲醇时提取效率最高，达到86%~104%(见表2)。因此，本方法确定了样品分两步提取：第一步用甲醇提取抗氧化剂和防腐剂；第二步用50%甲醇水溶液提取甜味剂；之后将提取液混合，上机同时测定各组分。 表2 各种提取液的回收率(%) 甜味剂 甲醇：水 0：100 20：80 50：50 80：20 100：0 安塞蜜 15 64 79 74 39 糖精钠 0 0 79 20 16 苯甲酸 0 0 74 67 93 山梨酸 0 0 30 39 86 PG 0 0 19 27 99 NDGA 33 27 11 68 102 TBHQ 17 19.4 53 85 101 BHA 16.4 19.7 58 90 104 OG 0 0 36 83 104 LG 0 8 72 109 BHT 0 0 44 92 2.3 方法的回收率、精密度、检出限和线性范围 在最佳色谱分离条件下，测定了各组分的线性范围；对样品进行了两个浓度水平的加标实验后，计算出了方法的回收率和方法精密度；根据信噪比推算出各组分的定性检出限和定量检出限，结果见表3。 表3方法的回收率、精密度、检出限和线性范围 加标量(g/kg) 回收率(%) 精密度(%) LOD(mg/kg) LOQ(mg/kg) 线性范围(pg/ml) 回归方程 r 安塞蜜 0.025 104.4 9.1 0.04 0.13 0.5~150.0 Y=9.1×10X-1.1×104 0.9999 0.075 99.6 2.3 糖精钠 0.025 99.9 9.9 0.08 0.27 0.5~150.0 Y=4.4×10X+8.2×1030.9998 0.075 91.8 4.1 苯甲酸 0.05 97.6 12.5 0.04 0.13 1.0~300.0 Y=9.1×104X+17×104 0.9999 0.15 97.1 3.5 山梨酸 0.05 96.9 11.2 0.05 0.16 1.0~300.0 Y=7.5×10X+2.2×104 0.9999 0.15 100.7 10.9 PG 0.05 99.3 10.2 0.09 0.29 1.0~300.0 Y=4.1×10*X+5.9×1030.9998 0.15 101.8 12.7 NDGA 0.05 106.3 12.4 0.22 0.76 1.0~300.0 Y=1.6×10X-4.7×100.9999 0.15 101.8 10.4 TBHQ 0.05 101.1 7.6 0.08 0.24 1.0~300.0 Y=4.9×104X+4.4×103 0.9999 0.15 94.6 7.9 BHA 0.05 95.8 7.3 0.10 0.33 1.0~300.0 Y=3.6×10X+4.3×10 0.9999 0.15 105.2 8.3 OG 0.05 99.2 7.6 0.12 0.40 1.0~300.0 Y=3.0×10X-2.5×104 0.15 106.1 8.1 0.9996 LG 0.05 94.8 8.5 0.13 0.45 1.0~300.0 Y=2.7×10X-1.4×104 0.9998 0.15 100.3 8.9 BHT 0.05 78.0 8.9 0.18 0.60 1.0~300.0 Y=2.0×10X-2.6×100.9999 0.15 80.5 8.8 2.4 实际样品的测定 抗氧化剂进行了测定，结果见表4。 使用上述方法，对市售20种月饼中的甜味剂、防腐剂和 表4月饼中甜味剂、防腐剂和抗氧化剂的测定结果(mg/kg) 序号 安赛蜜 糖精钠 苯甲酸 山梨酸 PG NDGA TBHQ BHA OG LG BHT 1 (-) (-) 3.2 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 2 (-) (-) 9.2 127.4 (-) 2.9 (-) (-) (-) (-) (-) 3 1.2 (-) 8.5 0.2 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 4 (-) (-) 2.4 189.5 28.4 (-) (-) (-) (-) 6.3 (-) 5 (-) (-) 1.0 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 6 (-) (-) 2.9 70.9 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 7 (-) (-) (-) 50.1 0.5 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 8 (-) (-) (-) 0.9 0.9 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 9 (-) (-) (-) 4.9 4.9 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 10 (-) 7.5 (-) 185.7 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 11 0.7 (-) (-) 67.0 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 12 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 13 (-) (-) 1.4 297.2 (-) 13.7 (-) (-) (-) (-) (-) 14 (-) (-) (-) 72.2 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 15 (-) (-) (-) 118.4 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 16 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 17 (-) (-) (-) 85.6 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 18 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 19 (-) (-) 2.7 191.9 (-) (-) (-) (-) (-) 6.9 (-) 20 (-) (-) (-) 8.3 7.9 (-) (-) 3.9 (-) (-) (-) 注：(-)表示未检出。 ( [参考文献] ) ( [1]凌关庭，编.食品添加剂手册[M].北京：化学工业出版社， 1997.766-768. ) ( [2]殷日昌，寇相波，刘国全.食用油中 PG 的测定[J].中国油脂， 2000，25(2)：58-59. ) ( [3]王文凤，马秋丽.气相色谱法测定香口胶中抗氧化剂 BHA、BHT [J].中国公共卫生，1994，10(3)：128. ) ( [4]胡小钟，余建新，孙国保，等.用高效液相色谱法同时测定油脂中 的9种抗氧化剂[J].分析测试学报，1999，18(5)：21-24. ) ( (收稿日期：2005-03-31) ) 为保证月饼的质量和风味，延长月饼的货架期，在月饼加工过程中经常加入抗氧化剂、甜味剂和防腐剂，二这些化合物对人体有一定危害，因此对月饼中常用的抗氧化剂、甜味剂和防腐剂的监测十分必要！目前测定抗氧化剂、甜味剂和防腐剂的方法主要有薄层色谱法、比色法、气相色谱和液相色谱法，而同时测定抗氧化剂、甜味剂和防腐剂的方法鲜有报道。为此我们对月饼中的常见7中抗氧化剂：BHA/BHT/PG/OG/LG/TBHQ/NDGA;2种甜味剂：安赛蜜、糖精钠；2种防腐剂：苯甲酸、山梨酸这11种化合物同时进行测定的研究！本实验采用的重点仪器：Waters-2695液相，配有Waters-Allains2695泵系统，Waters-2996二级管阵列检测器