人血清中米卡芬净及代谢物检测方案(液相色谱仪)

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SSL-CA14-902Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-379 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心 LCMS-8050CL 用于人血清中11种抗真菌药及代谢物的同时分析 LCMSMS-379 摘要：本文利用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱 (LCMS-8050CL) 对血清中11种抗真菌药及代谢物进行定 性定量分析。血清样品使用试剂盒提供的试剂除蛋白后，离心，移取上清液，进样分析。采用电喷雾离子源，正、负离子模式， MRM 模式采集数据，内标法定量。结果显示，在各自的线性范围内，氟胞嘧啶等11种抗真菌药及代谢物的线性良好，线性相关系数>0.995。低、高两个浓度的质控样品定值结果与标示浓度的偏倚位于75%~125%之间，同时，进行了重复性实验，保留时间的 RSD ≤0.39%，浓度的 RSD ≤7.96%。该方法可用于临床样本的快速、准确定量。 关键词：液相色谱-三重四极杆质谱医用质谱仪治疗药物监测 (TDM)抗真菌药 近年来，真菌感染的发生概率大幅上升，其主要原因是接受器官移植、免疫抑制疗法以及患艾滋病人群增加导致的。抗真菌药物有了很大的进展，但是真菌感染的发病率与死亡率仍然很高，临床上抗真菌药物的选择与疗法由医生决定。抗真菌药物的血清浓度监测被证明对于治疗真菌感染的给药方案优化甚至预防真菌感染都是最有效的方法之一。常用的抗真菌药物主要分为多烯类、吡咯类、棘白菌素类以及氟胞嘧啶等。吡咯类的药物，如伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑以及代谢物羟基伊曲康唑，由于其广谱抗菌性，广泛用于真菌治疗的感染。吡咯类抗菌药主要通过抑制一种或多种 CYP酶活性来治疗真菌性感染。棘白菌素类抗菌药毒副作用较小，例如 阿尼芬净、米卡芬净，临床上主要与其他类抗真菌药联合使用。由于药代动力学特征、副作用、药物相互作用和药物基因组学显著差异，抗真菌药在治疗过程中血药浓度个体差异很大。例如5-氟胞嘧啶35-70 mg/L是正常范围，而两性霉素B的治疗浓度位于 0.2-3.0 mg/L。这给治疗药物监测带来了挑挑。 目前已有一些文献建立了同时分析血清中四种抗真菌药物的LC-MS分析方法，主要包括氟康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑等三唑类抗真菌药。本文使用试剂盒方法，建立了血清中11种抗真菌药的 LCMS分析方法，前处理方法简便，分析通量高，适用于临床样品的快速、准确分析。 1.1仪器 岛津医用质谱仪：超高效液相色谱仪 LC-30A CL 与三重四三杆质谱仪LCMS-8050 CL 联用系统。LC-30A CL 系统包括 LC-30AD CL×2(输液泵)，DGU-20A，CL(在线脱气机)， SIL-30ACMPCL(自动进样器)， CTO-30A CL (柱温箱)，CBM-20A CL 系统控制器， LCMS-8050 CL 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.60色谱工作站。 1.2分析条件 流动相：A相-0.1%乙酸+5mM乙酸铵水溶液；B相-乙腈 流速：0.4mL/min 色谱柱： Shim-packGIST 2.1 mm l.D.×50 mm L.，2.0 um 柱温：40℃ 进样体积： 1uL (Co-injection，纯水=10 uL) 洗脱方式：梯度洗脱，见表1 表1梯度洗脱条件 时间 单元 处理命令 值 0.30 B.Conc 0.40 B.Conc 1.50 B.Conc 2.00 B.Conc 2.10 B.Conc 3.50 控制器 Stop 质谱条件： 离子源： ESI+(-) 接口电压：4.5kV(-3.0 kV) 雾化气：3.0L/min 加热气流量：10.0 L/min 接口温度：300℃DL 管温度：250℃加热块温度：400℃扫描模式： MRM模式，见表2 干燥气流量：10.0 L/min 表2MRM参数 化合物 英文名 类型 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 内标组 氟胞嘧啶 5-Fluorocytosine 目标 130.0 130.0 58.0* 112.9 -10 -10 -37 -23 -22 -19 1 两性霉素B Amphotericin B 目标 924.4 924.4 743.5 906.6* -28 -28 -21 -13 -20 -32 2 阿尼芬净 Anidulafungin 目标 1140.4 1122.5* -34 -17 -42 7 1140.4 1104.6 -38 3 -38 氟康唑 Fluconazole 目标 306.9 238.1* -22 -12 2 306.9 220.0 -22 -12 -12 羟基伊曲康唑 目标 721.1 408.2* -28 -39 -27 3 Hydroxy-Itraconazole 721.1 392.2 -22 -36 -26 艾莎康唑 Isavuconazole 目标 438.2 224.0* -21 -13 4 438.2 369.0 -21 -15 705.1 392.2* -22 -26 伊曲康唑 Itraconazole 目标 705.1 432.2 -22 -34 -29 5 酮康唑 Ketoconazole 目标 531.2 489.3* -10 -25 -13 6 531.2 244.2 -13 -30 -10 泊沙康唑 Posaconazole 目标 701.2 614.3* -22 -36 -28 7 701.2 344.2 -22 -22 伏立康唑 Voriconazole 目标 350.2 281.2* -29 -11 8 350.2 127.2 -29 -11 13C，15N，-氟胞嘧啶 13C，15N，-5-Fluorocytosine 内标 133.1 115.0 -10 -19 1 d4-氟康唑 d4-Fluconazole 内标 310.9 242.1 -22 -24 -12 2 d5-羟基伊曲康唑 d5-Hydroxy-Itraconazole 内标 726.2 413.2 -28 -39 -27 3 -3C，d4-艾莎康唑 13C，d4-Isavuconazole 内标 443.0 224.0 -21 -8 -13 4 d5-伊曲康唑 d5-Itraconazole 内标 710.2 397.2 -22 -38 -26 5 d8-酮康唑 d8-Ketoconazole 内标 539.3 497.3 -10 -25 -13 6 d4-泊沙康唑 d4-Posaconazole 内标 705.3 618.3 -22 -36 -28 7 d3-伏立康唑 d3-Voriconazole 内标 353.2 284.2 -29 -8 -11 8 米卡芬净** Micafungin 目标 1268.8 1268.8 300.3* 469.4 8 *定量离子对 **米卡芬净为ESI-，其余化合物均为ESI+ 1.3基质标准品、质控品及样品制备 参考德国 RECIPE《血清/血浆中抗真菌药试剂盒使用指南》，进行样品制备。 该试剂盒包含以下部分： 基质标准品：3个水平的人血清基质加标冻干粉 质控品：2个水平的人血清基质加标冻干粉 内标：含c，5N.氟胞嘧啶、d4-氟康唑等8种同位素标记的内标的冻干粉 优化用混标：冻干粉 蛋白沉淀剂：50mL 样品释放剂：50mL 基质标准品 (Level 0~Level 3) 和质控品(LevelI、Levell)： 1.0mL纯水溶解，涡旋混匀 15 min。在15-30℃下，保质期1d(阿尼芬净、米卡芬净3h)；在2-8℃下保质期7d(阿尼芬净、米卡芬净2d)；在-18℃以下保质期1月(阿尼芬净、米卡芬净7d)； 内标工作液：准确加入5.0mL 蛋白沉淀剂，混匀，超声 15 min。在15-30℃下，保质期1d(阿尼芬净、米卡 芬净3h)；在2-8℃下保质期8d(阿尼芬净、米卡芬净2d)；在-18℃下保质期28d(阿尼芬净、米卡芬净7d)；优化用混标：加入2.0mL流动相B， 混匀。在15-30℃下，保质期1d(阿尼芬净、米卡芬净3h)；在2-8℃下保质期8d(阿尼芬净、米卡芬净2d)；在-18℃下保质期28d (阿尼芬净、米卡芬净7d)； 基质标准品、质控品和样品前处理方法： 分别精密吸取50uL标准品、质控品或血清样品溶液于2mL离心管中，然后加入100 uL内标工作液，涡旋 30 s；10000×g离心5 min， 取上清液，过 0.22 um 滤膜上机，转移至带内插管的1.5 mL 进样瓶， LCMS分析。 结果与讨论 2.1基质标准品色谱图 图1基质标Level1浓度色谱图 2.2线性范围 试剂盒中各级别基质标品浓度和线性回归各浓度的准确度如表3所示，按1.3中的分析条件进行分析检测，利用内标法制作校准曲线，线性良好，线性方程、相关系数见图2。 表3111种抗真菌药的校准曲线及定量限 化合物 基质标曲浓度 (ug/mL) 准确度(%) Level1 Level 2 Level 3 5-Fluorocytosine 5.12 39.7 117 99.0-100.8 Amphotericin B 0.084 1.72 5.23 90.8-109.5 Anidulafungin 0.461 3.17 8.98 87.9-109.3 Fluconazole 0.564 4.14 12.6 95.6-102.7 Hydroxy-Itraconazole 0.164 1.19 3.6 98.3-101.7 Isavuconazole 0.482 3.49 10.6 96.8-106.0 ltraconazole 0.133 0.955 2.94 98.6-102.5 Ketoconazole 0.406 2.89 8.34 98.1-102.9 Posaconazole 0.232 1.68 5.01 97.6-103.5 Voriconazole 0.265 1.93 5.9 96.2-106.2 Micafungin 2.12 14.9 46.3 96.2-104.7 LCMSMS-379 口校准曲线/光谱视图 口校准曲线/光谱视图 校准曲线/光谱视图 口<校准曲线/光谱视图 口◇校准曲线/光谱视图 人校准曲线光谱 人校准曲线光谱普 人校准曲线人光谱 Y=0.396956X-0.00406949 Y= 0.434036X-0.00870506 r^2=0.9999996 r=0.9999998 r2=0.9996574 r = 0.9998287 1.50积比 面积比 1.25-Anidulafungin 4-HIsavuconazole 1.00- 3- 0.75- 2- 0.50- 0.25- 1- 0.00 014 0.0 1.0 2.0 浓度比 0.0 2.5 5.0 7.5 浓度比 口校准曲线/光谱视图 口校准曲线/光谱视图 口校准曲线/光谱视图 人校准曲线人光谱 人校准曲线人光谱 Y= 0.493393X-0.0154183 Y=0.956941X + 0.00900752 r2 = 0.9998599 r= 0.9999299 r 2= 0.9999172 r=0.9999586 面积比 面积比比_ 4- 3Ketoconazole Posaconazole1 Micatungin 3- 3- 2- 2- 1- 01 0.0 2.5 5.0 浓度比 010 0.0 2.5 浓度比 <>校准曲线/光谱视图 J校准曲线人光谱 Y = 0.0111273X-0.0102004 r^2= 0.9993550 r = 0.999 面积比 0.5- 0.4- 0.3- 0.2- 0.1- 0.01 0.0 25.0 浓度比 图211种抗真菌药的线性方程及相关系数 2.3质控样品考察 按1.2中的分析条件和1.3中的前处理方法对试剂盒中的质控品 Levell 和 Level Ⅱ进行分析，标示浓度和允许波动范围如表4所示，实际检测浓度在允许波动范围内。 表4质控样品检测结果 化合物 标示浓度 (ug/mL) 允许波动范围 (ug/mL) 实测浓度(ug/mL) Levell LevelIl Level I Level II Levell LevelIl 5-Fluorocytosine 21.7 50.9 17.4-26.1 40.7-61.1 21.11 48.76 Amphotericin B 0.864 2.59 0.648-1.08 1.95-3.24 0.66 2.44 Anidulafungin 1.82 4.11 1.45-2.18 3.29-4.93 1.59 3.38 Fluconazole 2.29 5.4 1.83-2.75 4.32-6.48 2.33 5.45 Hydroxy-Itraconazole 0.654 1.56 0.523-0.785 1.25-1.87 0.67 1.51 Isavuconazole 1.92 4.55 1.54-2.31 3.64-5.46 1.91 4.57 ltraconazole 0.528 1.26 0.422-0.633 1.01-1.51 0.55 1.25 Ketoconazole 1.63 3.68 1.3-1.96 2.94-4.41 1.58 3.63 Posaconazole 0.91 2.18 0.728-1.09 1.74-2.61 0.96 2.19 Voriconazole 1.07 2.53 0.854-1.28 2.03-3.04 1.08 2.46 Micafungin 8.25 19.1 6.19-10.3 14.3-23.9 6.97 17.70 2.4 重复性考察 质控品 Levell和 Level Il 连续进样分析6次，计算保留时间及浓度的相对标准偏差(RSD)。结果如表5所示，11种抗真菌药物保留时间及浓度 RSD 均处于合理范围。 表5：重复性考察结果 化合物 保留时间RSD (%) 浓度RSD (%) Levell Level Il Levell Level ll 5-Fluorocytosine 0.09 0.16 0.81 0.87 AmphotericinB 0.39 0.30 7.36 7.22 Anidulafungin 0.23 0.26 7.96 2.09 Fluconazole 0.26 0.32 3.05 1.85 Hydroxy-Itraconazole 0.21 0.24 2.08 1.86 Isavuconazole 0.21 0.23 2.07 1.71 Itraconazole 0.19 0.20 1.30 0.99 Ketoconazole 0.25 0.27 2.47 0.74 Posaconazole 0.22 0.24 3.35 2.10 Voriconazole 0.24 0.27 3.66 5.37 Micafungin 0.23 0.26 2.06 3.80 结论 本文使用岛津医用质谱仪 (LCMS-8050CL)对血清中11种抗真及药及代谢物同时进行定性定量分析。血清样品经过蛋白沉淀后，进样分析。结果显示，氟胞嘧啶等11种抗真菌药及代谢物的线性良好，线性相关系数>0.995。低、高两个浓度的质控样品定值结果与标示浓度的偏倚位于75%~125%之间，保留时间的 RSD ≤0.39%，浓度的RSD≤ 7.96%。该方法可供临床实验室参考。 Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 上海市徐汇区宜州路180号B2栋 咨询电话：021-34193996 http：//www.shimadzu.com.cn Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai Hotline：021-34193996 本文使用岛津医用质谱仪（LCMS-8050CL）对血清中11种抗真菌药及代谢物同时进行定性定量分析。血清样品经过蛋白沉淀后，进样分析。结果显示，氟胞嘧啶等11种抗真菌药及代谢物的线性良好，线性相关系数> 0.995。低、高两个浓度的质控样品定值结果与标示浓度的偏倚位于75%~125%之间，保留时间的RSD≤0.39%，浓度的RSD≤7.96%。