血清中同型半胱氨酸、甲硫氨酸、叶酸和 5-甲基四氢叶酸检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA20-160Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-472 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050CL用于高同型半胱氨酸血症诊断应用研究 LCMSMS-472 摘要：本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL 及高同型半胱氨酸血症诊断试剂盒(液相色谱-串联质谱法，质谱生物科技有限公司)，建立了人体血清中同型半胱氨酸、甲硫氨酸、叶酸和5-甲基四氢叶酸同时测定的方法。使用试剂盒的内内、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度、精密度的考察。结果显示该方法专属性良好，标准曲线相关系数均大于0.998，准确度及精密度均满足试剂盒要求。该方法对高同型半胱氨酸血症的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。 关键词：LCMS-8050 CL 高同行半胱氨酸血症 诊断 同型半胱氨酸、(Hcy)是一种含硫氨基酸，：为蛋氨酸代谢过程中的中间产物。由于各种原因导致同型半胱氨酸代谢受阻，体内同型半胱氨酸异常堆积，外周血中同型半胱氨酸升高，即为高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸血症病因复杂，主要分为先天遗传型及后天获得型。后天获得型可由生活方式、饮食习惯、基础疾病(糖尿病、脑卒中、慢性肾脏病、肿瘤等)及药物等因素导致。据统计，全球高同型半胱氨酸血症的发病率是5%~7%，我国高同型半胱氨酸血症的发病率在20%以上，远高于一些发达国家，在北部地区、沿海地区患病率更高。 经典型同型半胱氨酸血症需与血同型半胱氨酸升高的其他相关疾病共同鉴别，包括钴胺素代谢障碍所致同型半胱氨酸血症、叶酸代谢障碍导致的疾病(如亚甲基脱氢酶缺陷及亚甲基四氢叶酸还原酶缺陷)，还有获得性的如叶酸缺乏等。 本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL 及高同型半胱氨酸血症诊断试剂盒(液相色谱-串联质谱法，质谱生物科技有限公司)，建立了血清中同型半胱氨酸、甲硫氨酸、叶酸和5-甲基四氢叶酸含量测定方法，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，供相关人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津临床用超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用系统。具体配置为 LC-30AD CL×2(输液泵)，DGU-20AsRCL(线线脱气机)，SIL-30ACMP CL(自动进样器)， CTO-30A CL (柱温箱))，， SPD-M20A CL (二极管阵列检测器) CBM-20ACL 系统控制器， LCMS-8050 CL 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：试剂盒提供 流动相：试剂盒提供 流速：0.4mL/min 柱温：40℃ 进样量：2uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为1%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.50 泵 B.Conc 1 1.60 泵 B.Conc 80 2.50 泵 B.Conc 95 4.50 泵 B.Conc 95 4.51 泵 B.Conc 1 6.00 控制器 Stop 质谱条件 分析仪器： LCMS-8050 CL DL 温度：150℃ 离子源： ESI(+) 加热模块温度：400℃ 雾化气流速： 3.0L/min 离子源温度：300℃ 干燥气流速：10.0 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热器流速：10.0 L/min MRM参数：见表2 表2 MRM参数 名称 简称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 同型半胱氨酸 Hcy 136.00 90.00 -28 -11 -17 同型半胱氨酸内标 Hcy-IS 140.00 94.00 -28 -11 -17 甲硫氨酸 Met 150.05 104.10 -14 -10 -30 甲硫氨酸内标 Met-IS 155.00 108.10 -14 -10 -30 叶酸 FA 442.10 295.05 -30 -16 -30 叶酸内标 FA-IS 447.10 295.10 -30 -16 -30 5-甲基四氢叶酸 5-MTHF 460.20 313.05 -16 -19 -23 5-甲基四氢叶酸内标 5-MTHF-IS 465.20 313.05 -16 -19 -23 1.3材料与方法 1.3.1材料 校准品：6个浓度牛血清白蛋白冻干品 质控品：高低浓度牛血清白蛋白冻干品 内标品：含4种测定组分同位素内标 蛋白沉淀剂：试剂盒提供 复溶液：试剂盒提供 1.3.2方法 试剂的配制 内标品溶液的配制：内标品使用前平衡至室温，用移液器精密量取2.4 mL复溶液至内标品小瓶中进行复溶，超声处理30 min，涡旋混匀，使其完全溶解。 试剂盒校准品及质控品样本的准备：校准品及质控品使用前平衡至室温，取试剂盒中校准品/质控品分别用400 uL超纯水进行复溶，室温静置 10 min 使其完全溶解。 样本前处理 取校准品、质控品和血清样本各120uL，依次加入到标记好的洁净的2mL离心管中。向以上各管分别加入预先配制好的内标品溶液20uL， 室温下振荡孵育 30 min 后，向各离心管中加入460 uL 蛋白沉淀剂，再振荡5min， 使蛋白充分变性。振荡结束后，取一个96孔蛋白磷脂去除板放在一个收集板上，从各离心管中吸取500uL溶液，加入96孔蛋白磷脂去除板各孔中。将加好溶液的96孔蛋白磷脂去除板和收集板放在正压装置上，加压将96孔蛋白磷脂去除板中溶液全部压下，收集全部滤液，将收集板放在氮吹仪上，常温氮气吹干后，向各孔中加入50 uL复溶液，用微孔板粘贴膜密封。设定振荡频率为700 rpm， 振荡 10 min后，将深孔板中的溶液转移至V型96孔板中，用铝箔制微孔板封套紧密覆盖Ⅴ型96孔板，上机测定。 结果与讨论 2.1 MRM 色谱图 图1 标准曲线最低浓度点色谱图 2.2线性关系 采用内标法建立标准曲线，结果如图2与表3所示。结果显示， Hcy 在2~64 umol/L、Met 在 2~64 umol/L、B9在8~256 nmol/L、5-MTHF在 8~256 nmol/L线性浓度范围内线性相关性良好，相关系数均在0.998以上，各标准点准确度在91.7%~107.0%之间，满足临床测定需求。 图 2 标准曲线图 表3 标准曲线结果 目标物 线性方程 线性范围 浓度单位 相关系数 准确度(%) Hcy Y=(0.405326)X+(0.852862) 2~64 umol/L 0.9989 95.5~105.9 Met Y=(0.576301)X+(0.0645820) 2~64 umol/L 0.9980 91.7~107.0 B9 Y=(0.0131804)X+(0.00703010) 8~256 nmol/L 0.9992 94.3~102.9 5-MTHF Y=(0.0113624)X+ (0.00635704) 8~256 nmol/L 0.9994 95.5~102.8 2.3质控样本准确度考察 按1.2中的分析条件和1.3中的前处理方法对试剂盒中的质控品进行分析，质控品的准确度结果如表4所示，结果显示，高低浓度质控品测定结果在94.0%~102.5%之间，完全符合试剂盒质控品准确度 80%~120%的要求。 表4准确度考察结果 名称 质控 理论值 测定值 浓度单位 准确度(%) Hcy 低质控 8.0 7.76 umol/L 97.1 高质控 32.0 30.09 umol/L 94.0 Met 低质控 8.0 7.85 umol/L 98.1 高质控 32.0 32.81 umol/L 102.5 FA 低质控 32.0 31.88 nmol/L 99.6 高质控 128.0 123.38 nmol/L 96.4 5-MTHF 低质控 32.0 31.62 nmol/L 98.8 高质控 128.0 128.59 nmol/L 100.50 2.4精密度验证 将标准曲线最低浓度点连续进样分析6次，峰面积精密度结果如表5所示，结果显示，所测定四种物质峰面积精密度在1.1%~3.5%之间，符合日常检测需求。 表 5 准确度考察结果 编号 Hcy Met FA 5-MTHF 1 3088545 3631184 206003 186330 2 3151232 3693452 210234 180278 3 3121287 3751287 211654 178439 4 3108971 3651289 218298 175490 5 3052367 3667658 209129 189223 6 3118911 3659127 226156 185901 平均值 3106886 3675666 213579 182610 CV% 1.1 1.2 3.5 2.9 2.5临床样品测定结果 取3批次血清样品，按1.3中的前处理方法及1.2中的分析条件进行测定，结果见图3及表6. 图 3 sample-1样品色谱图 表6人血清样本测定结果 编号 Hcy(umol/L) Met(umol/L) B9(nmol/L) 5-MTHF(nmol/L) Sample-1 3.5 26.3 17.8 87.5 Sample-2 13.2 33.1 5.0 29.5 Sample-3 7.0 23.9 6.1 34.0 结论 本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL 及高同型半胱氨酸血症诊断试剂盒(液相色谱-串联质谱法，质谱生物科技有限公司)，建立了人体血清中同型半氨酸、甲硫氨酸、叶酸和5-甲基四氢叶酸同时测定的方法。使用试剂盒的内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度、精密度的考察。结果显示该方法专属性良好，标准曲线相关系数均大于0.998，高、低浓度质控品测定结果准确度在94.0%~102.5%之间，峰面积精密度在1.1%~3.5%之间。该方法对高同型半胱氨酸血症的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。 岛津应用云 本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL及高同型半胱氨酸血症诊断试剂盒（液相色谱-串联质谱法，质谱生物科技有限公司），建立了人体血清中同型半胱氨酸、甲硫氨酸、叶酸和 5-甲基四氢叶酸同时测定的方法。使用试剂盒的内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度、精密度的考察。结果显示该方法专属性良好，标准曲线相关系数均大于0.998，高、低浓度质控品测定结果准确度在94.0%~102.5%之间，峰面积精密度在1.1%~3.5%之间。该方法对高同型半胱氨酸血症的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。