大鼠血浆中新型多肽药物（BNP类似物）检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA14-467 Excellence in ScienceCMSMS-283 D岛津全球应用技术开发支持中心上海市徐汇区宜宜州180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS测定大鼠血浆中的一种新型多肽药物(BNP类似物) CMSMS-283 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效忍相效谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8050 联用测定大鼠血浆中多肽类药物BNP类似物的方法。血浆样品经蛋白沉淀处理，再经岛津GL离心固相萃取小柱Mono Spin C18 进行离心固相萃取， 可在6.0 min内快速、准确地测定其中的BNP类似物。该方法去用奥曲肽作为内标定量，方法最低定量限5 ng/mL，线性范围为 5~2000 ng/mL， 相关系数大于0.997。低、中、高浓度质控样品，每个浓度的样品平行处理6份， 其精密度与准确度分别在1.98%~6.95%与 87.1~112.7%之间。方法回收率在 93.3%~111.1%之间，基质效应因子89.1%~98.9%之间，内标归一化基质效应因子在93.4%~103.7%之间。空白大鼠血浆不干扰最低定量限的准确测定，目标物BNP类似物和内标奥曲肽之间无相互干扰。高浓度样品(2000 ng/mL)分析完成后进行空白样品分析， BNP类似物和内标奥曲肽的通道中均没有明显的目标化合物干扰。该方法灵敏、稳定，，可以用于新型多肽药物BNP类似物的定量测定。 关键词：多肽药物 血浆 超高效液相色谱 三重四极杆质谱 脑钠肽(Brain Natriuretic Peptide， 简称BNP)是由心脏分泌的利尿钠肽家族的一员，由32个氨基酸残基组成的多肽。因其首先在猪脑中发现，故得名。可以促进排钠、排尿，具较强的舒张血管作用，可用于治疗心力衰竭。目前已上市的基因重组人BNP，国内制剂商品名为新活素，国外同类药名为奈西立肽(Nesiritide)。本文分析的目 标物是一种新型BNP类似物，与BNP具有较高的氨基酸同源性，且半衰期更长，具有较大的开发潜力和较高的开发价值。本文建立了一种测定大鼠血浆中新型多肽类药物(BNP类似物)的LC-MS/MS方法，快速、灵敏、准确，可用于大鼠血浆中新型BNP类似物的定量检测。 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 与三重四极杆质谱仪LCMS-8050 联用系统。具体配置为 LC-30ADx2输液泵， DGU-20A5在线脱气机， SIL-30ACMP 自动进样器， CTO-20A 柱温箱，CBM-20A 系统控制器， LCMS-8050 三重四极杆质谱仪， LabSolutions 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱： InertSustain Bio C18 (2.0 mm I.D.x100 mm L.， 1.9 um) 流动相：A相-0.2%甲酸水；B相-0.2%甲酸甲醇 流速：0.50 mL/min 溶剂共进样：样品体积：10pL，稀释剂(0.2%甲酸水)体积：50pL 柱温：60℃ 洗针液：丙酮/乙腈/异丙醇/水=1：1：1：1(含甲酸0.5%) 洗针模式：进样前后洗针， External only (进样针外壁清洗)， Rinse Pump>Rinse Port 洗脱方式：采用梯度洗脱，B相初始浓度为25% 时间程序见表1 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.01 Column Oven CTO.RVR* 1** 0.8 Column Oven CTO.RVR 0*** 1.00 Pumps Pump B Conc. 90 2.30 Column Oven CTO.RVR 1** 3.00 Pumps Pump B Conc. 90 3.01 Pumps Pump B Conc. 25 6.00 Controller Stop *：表示柱后流路切换阀；**：表示液相流路接入废液；***：表示液相流路接入质谱 质谱条件 离子化模式： ESI， 正离子模式分析 加热模块温度：400℃ 加热气：：空气15.0L/min接口电压：1.5kV雾化气：氮气 3.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)干燥气：氮气 5.0L/min驻留时间：40ms碰撞气：氩气，320kPa延迟时间： 3ms接口温度：：400℃MRM参数：见表2 DL 温度：150℃ 表2 MRM参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) 碰撞能量 Q3 Pre Bias (V) CE(V) BNP类似物 奥曲肽(内标) 738.85 [M+5H]+ 510.40[M+2H]2+ 655.30* -26.0 -32.0 -34.0 457.15 -26.0 -31.0 -23.0 103.10 -24.0 -53.0 -22.0 *代表定量离子对 1.3 对照品溶液及内标溶液的配制 用50%甲醇水将标准储备液逐级稀释成浓度为 0.05 ug/mL、0.1 ug/mL、0.2 ug/mL、0.5ug/mL、1 ug/mL、2 ug/mL、5 ug/mL、10 ug/mL、20 ug/mL、50 ug/mL的标准工作溶液；用50%甲醇水溶液将标准储备液逐级稀释成浓度为 0.12 ug/mL、1.2 ug/mL、12 ug/mL 的质控工作溶液。用50%甲醇水将内标储备液稀释为25 ng/mL 的内标工作液。 1.4样品处理方法 1.4.1蛋白沉淀 取45 uL大鼠血浆，加入5 uL 标准工作溶液，加入20 uL内标，摇匀，加入100 uL甲醇，摇匀，800 rpm 涡漩振荡 5 min， 6000 rpm 离心10 min， 取上清液110pL， 加入790 pL超纯水， 11400 rpm 涡漩振荡1 min， 备用。 1.4.2岛津GL Mono Spin C18 离心固相萃取 取 Mono Spin C18 离心固相萃取小柱，加300 puL 乙腈， 2000g 离心1 min，加300uL50%乙腈水溶液、2000g离心1min， 加300pL0.5%甲酸水溶液，2000g离心1min， 加850 pL1.4.1中的样品溶液，1000g 离心2 min， 2000 g 离心2 min， 加300 uL 0.5%甲酸水溶液，2000g 离心1 min， 3000g 离心1 min， 加 250 uL 60%甲醇水，10000g 离心1 min， 低吸附EP管收集洗脱液，14000 rpm 离心5 min， 进LC-MS/MS 分析。 整个前处理过程应使用低吸附EP 管及低吸附枪头。 结果讨论 2.1标准样品一级质谱图 m/z 图1BNP类似物一级质谱图 图2BNP类似物二级质谱图 图3奥曲肽一级质谱图 图4奥曲肽二级质谱图 2.2选择性 取空白大鼠血浆45 uL，不加标准工作液和内标，按照1.4进行样品处理，得到空白基质样品。取空白大鼠血浆 45 uL， 不加标准工作液，按照1.4进行样品处理，得到QCo样品。取空白大鼠血浆45 uL， 按照1.4进行样品处理，得到血浆加标样品。结果如图5~图10所示。结果显示，空白大鼠血浆中目目化合物 BNP 类似物和内标奥曲肽的通道均不干扰定量限样品的检测，内标物奥曲肽不会对 BNP 类似物的准确测定造成干扰。 (x100) 图5空白血浆 MRM 谱图-BNP类似物 图6空白血浆 MRM 谱图-奥曲肽 图7血浆加标样品 MRM 谱图-BNP类似物(5ng/mL) 图8血浆加标样品MRM谱图-奥曲肽 图9QC0样品 MRM 谱图-BNP 类似物 图 10 QC0样品 MRM谱图-奥曲肽 2.3线性范围和最低定量限 取大鼠血浆45 uL，加入标准系列工作液和内标，按照1.4中的前处理条件处理样品，得到血浆浓度为 5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL、500ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL 的标准曲线样品，按照1.2中的分析条件进行测定，内标法定量。所得校准曲线如图11所示，线性方程及相关系数见表3， 其中y值代表 BNP 类似物峰面积与奥曲肽峰峰积的比值，x值代表血浆中 BNP 类似物的浓度。方法检出限确定为5ng/mL，在此浓度水平，精密度和准确度均在接受标准内，6次重复分析 RSD 为 6.51%， 准确度为80.5~96.2%， S/N平均值为12.0。 图11 BNP类似物校准曲线(5~2000 ng/mL) 表3BNP类似物校准曲线参数(线性回归，权重为1/C²) 名称 校准曲线 线性范围(ng/mL) 准确度(%) 相关系数r BNP类似物 Y=(1.00×102)X+(2.98×10-3) 5~2000 86.4~111.6% 0.9969 2.4精密度与准确度 取大鼠血浆45 uL， 加入质控工作液和内标，按照1.4中的前处理条件处理样品，得到血浆浓度为 12 ng/mL、120 ng/mL、1200 ng/mL 的质控样品，每个浓度平行处理6个样品，按照1.2中的分析条件进行测定，考察质控样品的日内精密度与准确度，结果如表4所示。方法的日内精密度为1.98~6.95%，各浓度水平质控样品的准确度为 87.1~112.7%。 表4方法精密度与准确度(n=6) 理论浓度(ng/mL) 日内精密度 CV% 准确度% 10 6.95 87.1~99.2 120 5.51 96.8~111.7 1200 1.98 105.4~112.7 2.5回收率 考察三个质控样品 LQC、MQC、HQC(每个浓度重复6次)的回收率，结果如表5所示。各浓度水平 BNP 类似物的回收率在 93.3%~111.1%之间。 表5回收率(n=6) 浓度水平 理论浓度 实际浓度均值(ng/mL) 平均回收率 (ng/mL) LQC 12 11.2 93.3% MQC 120 130.2 108.5% HQC 1200 1333.4 111.1% 2.5基质效应 考察三个质控样品 LQC、MQC、HQC(每个浓度重复6次)的基质效应，结果如表6所示。结果表明，各浓度水平 BNP类似物的基质效应在89.1%~98.9%之间，内标基质效应因子为95.4%，内标归一化基质效应因子在 93.4%~103.7%之间。 表6基质效应(n=6) 浓度水平 理论浓度 基质效应因子 内标归一化基质效应因子 (pg/mL) LQC 12 94.5% 99.0% MQC 120 89.1% 93.4% HQC 1200 98.9% 103.7% 内标基质效应因子 95.4% 2.6残留 在高浓度样品(2000ng/mL) 后进样分析空白样品，考察 BNP 类似物和内标奥曲肽的残留情况。结果如图12、图13所示。 图12 BNP类似物残留考察 图13奥曲肽残留考察 结果表明，在高浓度样品进样分析后分析空白样品， BNP 类似物和内标奥曲肽的通道中均无明显目标化合物干扰。 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用测定大鼠血浆中多肽类药物 BNP类似物的方法。血浆样品经蛋白沉淀处理，再经岛津GL 离心固相萃取小柱 Mono Spin C18进行离心固相萃取，可在6.0 min 内快速、准确地测定其中的 BNP 类似物。该方法采用奥曲肽作为内标定量，方法最低定量限 5ng/mL， BNP类似物线性范围为5~2000ng/mL， 相关系数大于0.997，线性良好。低、中、高浓度质控样品，每个浓度的样品平行处理6份， 其精密度与准确度分别在1.98~6.95%与87.1~112.7%之间，方法精密度和准确度良好。不同浓度质控样品回收率在 93.3%~111.1%之间，基质效应因子在89.1%~98.9%之间，内标归一化基质效应因子在93.4%~103.7%之间。空白大鼠血浆不干扰最低定量限的准确确定，目标物 BNP 类似物和内标奥曲肽之间无相互干扰，方法选择性良好。高浓度样品(2000ng/mL)分析完成后进行空白样品分析， BNP 类似物和内标奥曲肽的通道中均没有明显的目标化合物干扰。该方法灵敏、稳定，可以用于血浆中新型多肽药物 BNP 类似物的定量测定。 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用测定大鼠血浆中多肽类药物BNP类似物的方法。血浆样品经蛋白沉淀处理，再经岛津GL离心固相萃取小柱Mono Spin C18进行离心固相萃取，可在6.0 min内快速、准确地测定其中的BNP类似物。该方法采用奥曲肽作为内标定量，方法最低定量限5 ng/mL，BNP类似物线性范围为5~2000 ng/mL，相关系数大于0.997，线性良好。低、中、高浓度质控样品，每个浓度的样品平行处理6份， 其精密度与准确度分别在1.98～6.95 %与87.1~112.7%之间，方法精密度和准确度良好。不同浓度质控样品回收率在93.3%~111.1%之间，基质效应因子在89.1%~98.9%之间，内标归一化基质效应因子在93.4%~103.7%之间。空白大鼠血浆不干扰最低定量限的准确测定，目标物BNP类似物和内标奥曲肽之间无相互干扰，方法选择性良好。高浓度样品（2000 ng/mL）分析完成后进行空白样品分析，BNP类似物和内标奥曲肽的通道中均没有明显的目标化合物干扰。该方法灵敏、稳定，可以用于血浆中新型多肽药物BNP类似物的定量测定。