食品，药物等中自由基检测方案(顺磁共振波谱)

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查看不可见： EPR 波测定降解 布鲁克拜厄斯宾有限公司 EPR 应用科学家 Kalina Ranguelova 博士。 材料降解是物理、化学和生物降解过程之间复杂的相互作用结果，这些过程通常涉及自由基。一些影响产品稳定性的过程是热(在氧气存在下的热降解和热氧化降解)、光(光降解)、氧气(氧化降解)和风化(通常是紫外线降解)， 产品保质期内保持稳定性很重要，稳定性研究不仅涵盖了产品的物理化学特性，还解释了产品在整个保质期内的安全性和有效性。强制降解(压力测试)研究是将压力或加速工况应用于产品研究。它们有助于促进产品开发、制造、生产和包装，其中自由基行为的知识可用于延长保质期并提高产品质量。 电子顺磁共振(EPR)波谱法是唯一能够以直接和非侵入性的方式检测带有自由基的物种分析技术。同时，该技术对没有自由基(或未配对电子)的样品完全是“盲目的”，因此它是非常特殊的。它的用途非常广泛，可以在很大的温度范围内应用于气体、液体或固体样品。EPR可用于检测、定量和监测短寿命物种的内在生成，因此对于检测聚合物、食品和饮料、药物和环境等中的自由基降解极其有用。EPR的信号幅度与目标产品的降解水平直接相关，因此分析非常简单直接。随着自旋捕获剂的研发以“捕获”寿命极短的自由基，应用范围扩大，有效地将其固定为一种可以用 EPR 测量的更稳定的形式。自旋捕获的一种常用方法是在硝酮捕获剂中加入自由基，从而形成旋转加合物，这是一种基于硝基氧的持久性自由基，可以用EPR 检测到。旋转加合物通常产生一个独特的EPR光谱，识别捕获的自由基。结果，EPR不仅在工业上得到广泛应用，而且在医学和药物领域的体外和体内研究中也得到了广泛应用。 本文旨在概述 EPR 在降解反应方面的应用多多性。 治疗药物需要具有良好的保质期，以确保正确用药和患者安全。研制成功的制剂取决于对其化学和物理稳定性和特性的深入了解。热、光、氧、湿度、杀菌过程、杂质和辅料相互作用是影响产品稳定性的因素。此外，所有这些因素都可能导致活性药物成分(API)、辅料或制剂的降解，导致产品效力的丧失或有毒副产品的产生。 降解过程往往涉及自由基和过渡金属，而这些自由基和过渡金属是药物产品中发生大部分损害的原因。 EPR 波谱法成功用于监测药物降解过程中自由基的形成，鉴定自由基中间体，并帮助确定反应机理。它可以确定降解的根本原因，测量降解的程度，并预测API、辅料和制剂的长期稳定性特征。由于EPR固有的高灵敏度，测量速度快，只需少量的API或药物制剂，因此该技术可用于药物研发的早期阶段。 辅料是药理活性药物或前药以外的物质，包含在制造过程中或成品药物剂型中。这些辅料通过增强 API 的治疗效果或通过促进制造过程来改善药物的特性，通常是药物产品中的主要成分。API 的直接降解不仅会降低产品的作用，而且辅料的降解还会通过改变药物的物理化学特性或与 API 反应来影响药物的功效。因此，在这些组分经过可能影响其稳定性的工业加工之后，对其稳定性进行评估是至关重要的。聚山梨醇酯是生物药物制剂中最常用的辅料之一，众所周知，聚山梨醇酯易被自由基链过程自动氧化降解。EPR 数据显示降解发生，并且在自由基形成的各种存储条件下被检测到。主要问题是这些自由基很容易氧化和降解蛋白质，对患者造成潜在的严重和不良影响(图1)。 图1.聚山梨醇酯20在不同贮存条件下的自由基浓度 在聚山梨醇酯中检测和量化自由基是了解其自氧化机制的关键步骤。使用我们的 EPR量化软件包 (SpinCount 和 SpinFit，布鲁克专利!)在在鲁克 Xenon 软件中应用，识别和量化聚山梨醇酯自由基的任务既简单又精精(图2)。 最近另一项研究主要在于Y和X辐照对L-组氨酸的影响， L-组氨酸是一种典型的肠外制剂辅料，用作皮下注射、肌肉注射和腹膜腔注射的缓冲剂和稳定剂【2】。作者得出结论，辐照可诱导组氨酸脱氨和C-中心自由基的形成(图3)。此外，自旋捕获也显示了辐照材料初始溶解很长时间内的自由基再生。Fenton 型化学涉及辐照过程中产生的强氧化剂，并由标准无菌注射器针头中的微量金属催化。 图2.左面板：本文给出了聚山梨醇酯中自旋捕获自由基的 EPR 波谱，并对其进行了完整模拟，在顶部以灰色显示。从模拟光谱(虚线迹)中，利用自旋模型识别出三种不同的自由基——烷氧基(模拟为红色)、氧化基(模拟为橙色)和烷基(模拟为蓝色)。使用 SpinCount 组件确定每个自由基物种的浓度。右面板：拟议的聚山梨醇酯自氧化机制与EPR数据密切相关。反应图示引自参考文献【1】。 图3.Y-辐照下L-组氨酸的脱氨基(引自参考文献【2】) 根据作者的观点，在处理用于肠外制剂的辅料时，.了解溶液中反活性降解产物的行为是必不可少的。避免溶液中的自由基再生是必要的，可以消除完整药物制剂中的自由基诱导其他药物成分(尤其是API)降解的可能性。无意中向患者注射含有自由基的溶液也可能产生直接的毒理学影响。虽然仍有必要对每种辐照灭菌产品进行彻底分析，但评估Y辐照对单单药物成分的影响是分析多组分体系的首要步骤。 Ⅱ.抗氧化剂功效 几十年来，人们已经认识到材料和产品中需要抗氧化剂。抗氧化剂通过减少自由基中间体和防止活性氧的增殖来抑制其其分子的氧化。因此，抗氧化剂在每种产品中都是必不可少的。然而，还有一个有待解决的问题：抗氧化剂的长期作用是什么?他们是否能够为产品提供必要的持久保护，这对防止降解和缩短保质期真的很重要。EPR是一种评价抗氧化活性的工具。在考虑到不同参数的情况下确定抗氧化剂功效：活性、动力以及典型压力测试对其性能的影响。例如，紫外线滤光是化妆品防晒制剂配方中吸收特定波长紫外线辐射的关键成分【3】。理想情况下，防晒霜应能防止由紫外线B引起的晒晒/红斑，以及紫外线A和紫外线B对皮肤光损伤的基因毒性/氧化作用。为了使防晒霜具有最佳的性能和功效，首要的要求是紫外线滤光在整个曝晒期间都应保持有效。在不同的紫外滤光影响下，对稳定自由基 (TEMPOL) 的 EPR 信号进行25分钟的紫外辐照，显示其降低自由基的效率(图4)。很明显，在防晒制剂中消除自由基的方法中紫外线滤光D是最有效的。 图4.紫外线滤光功效由 EPR 确定。紫外线滤光抑制自由基的能力按以下顺序增加： A 关闭