水中沙星类抗生素药物检测方案(固相萃取仪)

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自动化样品前处理解决方案-RK-2019-W008 水中沙星类抗生素药物的测定解决方案 1.介绍 沙星类(Quinones， QNs)抗生素(图1)是一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以及毒副作用小、价格低廉等特点，被大量用于治疗和预防水生动物疾病及促生长。但研究表明，所使用的抗生素仅20~30%被鱼类吸收，大部分进入环境中，而这部分抗生素再次进入食物链，可能导致养殖环境中病菌耐药性的产生，导致二次污染。这不仅影响到水产养殖业的健康发展，而且还威胁着生态环境的安全。水样中残留喹诺酮类抗生素，通过饮用进入人体，可能对人体肝脏功能造成严重损伤。因此，建立水环境中这类药物的检测方法尤为重要。目前，喹诺酮类药物残留检测方法，主要包括 HPLC-UV、HPLC-FD、HPLC-DVD、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS， 另外还有荧光光谱法、毛细管电泳法和酶联免疫法等。 依诺沙星 奥比沙星 沙拉沙星 司帕沙星 图1.16种沙星类抗生素的结构式 本报告选择MCX阳离子交换柱进行富集、净化，超高压液相色谱-串联质谱 (HPLC-MS/MS) 联用技术检测，建立了环境水样中高灵敏的分析方法，该方法有望应用于水产养殖中。 关键字：：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；抗生素； Fotector Plus； Auto EVA-60 2.仪器与试剂 甲醇，乙腈(TEDIA色谱纯)；甲酸，氨水(优乡纯)。 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 3.样品前处理 Raykol Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪 3.1固相萃取净化条件 MCX 固相萃取柱 (Waters， Oasis， 200 mg/6mL) 高效液相色谱：(HPLC) Agilent 1260，质谱检测器(MS) Agilent 6410。 全自动固相萃取仪 Fotector Plus高通量全自动固 相萃取仪 固相萃取柱 MCX(Waters， 200 mg/6 mL) 活化 甲醇 淋洗 pH=4.0 的甲酸水溶液 洗脱 5%的氨水甲醇溶液 3.2富集净化 依次用甲醇(10mL)和水(10mL)以5.0mL/min的速率活化/平衡和淋洗固相萃取柱，备用。取纯净水样 200 mL，加入标准品(100L， 100 ppb)，加入 EDTA-MCIlvaine 缓冲溶剂(50 mL， 0. 1 mol/L) 调节水环境的 pH为4，以5mL/min 的速率经固相萃取小柱富集后；用甲酸水溶溶液(pH=4.0) 10 mL以 10 mL/min 速率淋洗；气推后用 10 mL 的5%氨水甲醇以 1.0 mL/min 的速率洗脱。收集的样品在25℃， 5 psi 条件宿浓缩至近干，流动相乙腈-水溶液(10：90，v/v， 0.1%甲酸)定容至1.0mL，供LC/MS-MS 分析。全自动固相萃取方法见图2。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积 时间[min 1 活化 MeOH (Methanol) 废液2 5 10 2.6 2 活化 pH4.0 Formic Acid/Water 废液1 10 10 1.6 3 大体积上样 sample-1 废液1 6 200 115.3 4 淋洗 pH4.0 Formic Acid/Water 废液1 5 10 2.6 5 气推 废液1 30 20 2 6 洗脱 5%ammonia/MeOH 收集 1 10 10.5 7 气推 20 5 0.8 8 结束 图2. Fotector Plus水中啥沙星抗生素固相萃取方法 4.液质检测条件 4.1色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5um×2.1 mm×50mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A： 10 mM ammonium acetic (0.1% formic acid)， B： Methanol 柱温 30°C 进样体积 10uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350°C 簇电压 4000 雾化压力 35psi 梯度洗脱 0.0-1.0 min， 90%流动相A； 1.0-4.0 min，50%的流动相；50%流动相A保相2 min； 6.01-7.01 min，90%的流动相A； 7.01-10.0 min， 90%的流动相A 保持3 min。 4.2 MRM参数 Compound Precursor Product Ion Dwell Fragmentor Collision Cell Accelerator Name Ion Energy Voltage 依诺沙星 321.2 303.2 20 125 20 7 232.1 20 36 7 氟罗沙星 370.0 370.0 20 13 7 326.2 20 135 25 诺氟沙星 320.2 302.2 20 130 18 7 233.1 20 130 22 7 362.2 318.2 20 140 16 7 氧氟沙星 261.1 20 140 26 7 334.2 316.2 20 145 18 7 培氟沙星 290.3 20 145 14 7 环丙沙星 332.2 314.2 20 125 18 7 231.1 20 125 40 7 洛美沙星 352.3 308.2 20 120 14 7 265.1 20 120 22 7 丹诺沙星 358.2 340.2 20 135 20 7 255.1 20 135 42 7 恩诺沙星 360.2 342.2 20 135 20 7 316.2 20 135 16 7 奥比沙星 396.4 396 20 135 21 7 295.1 20 135 37 7 沙拉沙星 386.2 342.2 20 125 18 7 299.2 20 125 30 7 双氟沙星 400.2 356.3 20 135 18 7 299.1 20 135 30 7 司帕沙星 393.3 349.3 20 150 18 7 292.2 20 150 26 7 氟甲喹 262.1 262.1 20 105 13 7 244.1 20 105 33 7 噁喹酸 262.2 262 20 100 13 7 244 20 100 29 萘啶酸 233.2 233 20 90 9 215.1 20 90 25 7 表1.16种抗生素的串联质谱检测参数 4.3色谱图 图3. 16 种喹诺酮标准物质的 MRM色谱图 (5 ng/mL， 进样量10pL) 5.样品测试 5.1 基质效应验证 取纯净水样，按照上述的样品处理步骤后，氮吹至近干，加入标准使用液(1ppm， 20 L)，定容成1mL，供LC/MS-MS检测。如果基质加标浓度准确，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标做曲线进行单点定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重 相等，拟合出工作曲线，要求R>0.99；此曲线两周需要重新配置一次。 5.2样品基质加标测试 对桶装纯净水和生活废水进行加标实验，加标浓度为低浓度(25 ng/L)、中浓度(50 ng/L)和高浓度(100ng/L)，结果如表表所示：除了恩诺沙星和司帕沙星在76.9~79.4%外，大部分的加标回收率在82.5~114.2%之间， RSD 在1.5~16.6%。该方法能够实现对水样中16种喹诺酮抗生素进行检测。 104.2 Concentration of standard spiked martrix samples (ng/L) 7.4 生活废水加标浓度(n=4) Concentration of standard spiked martrix samples(ng/L) 25 50 100 25 100 平均回收率(%) RSD(%) 平均回收率(%) RSD(%) 7.5 平均回收率(%) 107.6 RSD(%) 6.4 平均回收率(%) 99.0 RSD(%) 10.3 平均回收率(%) 86.7 RSD(%) 伊诺沙星 氟罗沙星诺氟沙星氧氟沙星培氟沙星环丙沙星洛美沙星丹诺沙星恩诺沙星奥比沙星沙拉沙星双氟沙星司帕沙星氟甲喹 噁喹酸 109.0102.5114.2107.7110.9104.7104.2107.799.693.5100.297.976.999.699.6110.9 10.312.9 12.66. 16.07.47.414.99.010.37.412.08.410.4 10.4 6.6 95.5 104.0100.0102.891.3100.7107.5101.177.497.5113.294.795.2105.7 114.3 4.6 92.5 12.9 94.9 9.7 14.6 105.7 112.4 2.0 104.2 12.6 99.7 11.1 103.299.9 114.2 4.0 107.7 6.1 100.3 6.4 114.1 1.5 100.9 97.3 13.3 104.1 2.47.33.89.8 89.2107.990.995.0 16.6 109.7 107.9 15.4 12.45.1 106.0 8.2 95.8 2.5 10.3 96.4 6.6 100.2 7.4 84.5 4.0 94.7 6.0 111.9 9.8 97.9 12.0 90.0 9.3 88.6 14.4 76.9 8.4 84.3 1.8 102.2 5.6 99.6 10.4 82.5 3.0 99.7 99.3 9.4 7.1 99.6 110.9 10.46.6 83.2 86.5 3.7 5.3不同类型固相萃取柱对沙星类化合物的富集效果 取纯净水为样品，加标的质量浓度分别为50ng/L， 按照上述方法，进行4平行样测定，考察该方法的不同固相萃取柱的回收率和重现性，分析结果如图-4所示：纯净水中抗生素的平均回收率分布 在65.00-91.38%(HLB)，，71.21-152.28%(MAX)和77.41-123.21%(MCX)。HLB回收率普遍偏低， MAX柱中沙星的回收率偏高，培氟沙星和氧氟沙星的回收率均超过了140%，而且MAX 柱需要在水样中加入氢氧化钠，容易造成水样中金属离子的水解沉淀，容易造成管路的堵塞。相比之下 MCX 柱的平行性比 热线：400-885-1816 图4.三种柱子的回收率对比 6.1对于16种沙星类化合物在水中的富集方法，应考虑实验过程中基质对化合物检测的干扰。此步的干扰不仅来自于水样中杂质干扰，同时商业化的固相萃取小柱，使用的色谱级溶液等等都存在干扰杂质，因此需要进行基质效应确认，以避免前处理富集过程中存在基质效应。 6.2氮吹浓缩过程中应控制吹干程度，不可过分干燥。 6.3对于沙星类的两性化合物，在pH=7.0 左右时，主要以带负电荷的形式存在水溶液中，此时进行富集，固相小柱无法对目标物进行吸附。因此需要进行 pH调节至4.0左右，使其成为带铵根的正离子，利于下一步进行阳离子交换柱富集。 6.4淋洗时采用甲酸酸化的水溶液，利于将固相萃取小柱中中留的 EDTA 除去，避免其在后续的洗脱液中干扰沙星类化合物的检测。 7. 解决方案的优势 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪能同步进行6个样品处理，自动连续处理60个样品，从活化、上样、淋洗到洗脱等多种基础命令全部实现自动化，大大提高了仪器精度和可靠性，保证了回收率。 AutoEVA-60全自动平行浓缩仪可自动完成对小体积样品的快速，，平行浓缩。 邮箱： info@raykol.com热线：址：：Vwww.raykol.com 热线：箱： info@raykol.com网址：：Vwww.raykol.com 本报告选择MCX阳离子交换柱进行富集、净化，超高压液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）联用技术检测，建立了环境水样中高灵敏的分析方法，该方法有望应用于水产养殖中。