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SSL-CA19-160Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-QTOF-016 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心http://www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话:021-34193996Hotline:021-34193996Building B2, No.180 Yizhou Road, Shanghai 液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用法定量检测盐酸雷尼替丁原料药中的N-亚硝基二甲胺 LCMS-QTOF-016 摘要:本文使用岛津液相色谱-四极杆飞行时间质谱 (LCMS-9030) 对盐酸雷尼替丁原料药中的N-亚硝基二甲胺 (NDMA) 进行定量分析。通过紫外色谱图确定雷尼替丁主峰的出峰时间,使用质谱前端配置的流路切换阀,将其切入废液。NDMA 出峰时间在 4.1 min, 为尽可能降低质谱的污染,质谱的切入时间设置为2.5到4.5min。系统适用性实验结果表明连续六次1 ng/mL标准溶液的 S/N 均大于10, 1 ng/mL为本法的定量检出限。2 ng/mL标准溶液连续进样6次,峰面积重复性<10%。在1.14-146 ng/mL 浓度范围内,方法线性良好,相关系数>0.999。曲线各标点浓度计算结果准确度在86.95-112.32之间,均满足法规要求。外标法计算六份供试品中NDMA含量,测定结果均小于0.32 ppm。 关键词:液相色谱-四极杆飞行时间质谱 Q-TOF盐酸雷尼替丁 NDMA 雷尼替丁是一种广泛用于治疗和预防胃肠溃疡的组胺H2受体拮抗剂。目前,据报道国内外多家药企的雷尼替丁原料药和成品药中检出N-亚硝基二甲胺(NDMA)。NDMA是一种亚硝胺类物质,被证实是一种致癌物。雷尼替丁受热可能分解生成 NDMA, 使用 GCMS测定结果将偏高。2019年9月13日FDA更新了雷尼替丁中 NDMA的检测方法,方法中采用了液 质高分辨质谱法,要求雷尼替丁原料药中检出浓度不得高于 0.32 ppm。 本文使用岛津高分辨质谱仪 LCMS-9030,配备超高效液相色谱仪 Nexera 用于雷尼替丁原料药中NDMA含量测定。本方法操作简单、快速、灵敏度高、重复性好且线性良好,可供相关检测机构参考。 I实验部分 1.1仪器 岛津超高效液相色谱仪 Nexera 系统串联四极杆飞行时间质谱仪 LCMS-9030(配在线流路切换阀)。Nexera 系统包括LC-30AD×2(输液泵), DGU-20A5(在线脱气机),SIL-30AC自动进样器), CTO-20AC (柱温箱),SPD-M20AA((二极管阵列检测器), CBM-20Alite(系统控制器)。。数据采集使用 LabSolutionsVer5.97, 数据处理使用 LabSolutions Insight 3.4。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱: Shim-pack GIST 4.6 mm l.D.×150 mm L, 5.0 um 流动相:A相-0.1%甲酸水;B相-甲醇 流速:1.0mL/min 柱温:40℃ 进样器温度:5℃ 进样量:5uL 检测波长:190-400 nm 洗脱方式:梯度洗脱,B相初始浓度为5%,洗脱程序见表1。 表1梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 2.50 Pumps Pump B Conc. 5 6.00 Pumps Pump B Conc. 15 9.00 Pumps Pump B Conc. 100 19.00 Pumps Pump B Conc. 100 19.10 Pumps Pump B Conc. 5 25.0 Controller Stop 质谱条件 分析仪器: LCMS-9030 接口温度:300℃ 离子化模式: APCI(+) DL温度:180C 干燥气:空气5.0L/min 加热模块温度:200℃ 雾化气:氮气3.0L/min MS scan range: 50-95 m/z 质谱采集时间:2.5-4.5 min Threshold: Low Event times(s): 0.1 Corona Needle Voltage: 3.5 kV EIC 是取 m/z:775.0553 EIC 提取误差:15ppm 1.3对照品溶液制备 精密称取N-亚硝基二甲胺对照品10 mg,用甲醇定容至10 mL容量瓶中,制得1mg/mL N-亚硝基二甲胺储备液。 对照品测试溶液:从上述储备液中移取适量,用甲醇稀释制成1mL中约含2 ng的溶液。 灵敏度测试溶液:从上述储备液中移取适量,用甲醇稀释制成1mL中约含1ng的溶液。 1.4供试品溶液制备 精密称取供试品120 mg 放入 15 mL棕色玻璃瓶中,加入4mL甲醇涡旋5分钟至样品充分溶解后,转移至进样小瓶,待检。 结果与讨论 2.1盐酸雷尼替丁原料药紫外色谱图 盐酸雷尼替丁原料药中NDMA含量极其微量。为追求检测灵敏度需提高进样体积。进样体积过大将引起NMDA和雷尼替丁分离度下降,阀切不充分带来仪器污染。同时也会带来溶剂效应,使得色谱峰展宽。因此需在保证灵敏度的前提下,尽量减小进样体积。本次实验优化后的进样体积为5uL。 由于不同色谱系统的延迟体积的差异, NMDA和雷尼替丁的保留时间会发生变化。因此建议配置紫外检测器进行雷尼替丁原料药色谱图的监控。 本法选择了 GIST4.6内径的5 um 常规色谱柱。优点如下:在常规柱上NDMA和雷尼替丁主峰的保留时间间隔相比同款 3 um常规色谱柱大大增加。在甲醇做流动相的条件下,时间间隔为1.6 min,可确保充分的阀切时间将雷尼替丁主峰完全切至废液。流速选择1 mL/min,此流速兼顾该款色谱柱和APCI源的最佳使用条件,同时又起到快速洗脱原料药的目的。 盐酸雷尼替丁原料药254 nm 下紫外色谱图见图1。进样浓度为30 mg/mL, 主峰前沿时间点为5.73min。因此质谱检测器务必在此时间点前切入废液,以免污染质谱。主峰出峰后 9-19 min 进行色谱系统的深度冲洗,可避免原料药在柱上残留干扰后续分析。 图1盐酸雷尼替丁原料药紫外色谱图 2.2系统适用性试验 NDMA标准溶液出峰时间为4.1 min, 为避免原料药样品污染离子源,尽可能缩短质谱的采集时间。本方法中设置2.5-4.5 min 导入质谱,其余时间均切入废液。噪音的选取范围为2.8-3.8 min, 使用ASTM 法计算S/N, 实验结果显示1 ng/mL 灵敏度测试液连续进样六次, S/N 均高于12.8;2 ng/mL对照品溶液连续进样六次, S/N均高于39.1。由此确定1 ng/mL为本法定量限。甲醇空白溶液、1ng/mL标准溶液和 2 ng/mL标准溶液典型色谱图见图2。 图2空白和NMDA标准溶液色谱图 样品分析前, 2 ng/mL对照品溶液连续分析6次, NDMA 峰面积的 RSD 为 8.4%,满足法规<10%要求。样品分析中,每隔6个样品进一针对照品溶液。所有 NDMA对照品溶液峰面积的 RSD 为 8.15%。质谱扫描宽度为 50-95 m/z之间,精确质量数均小于15 ppm。以上均满足法规要求。 表2 NDMA2ng/mL标准溶液重复性结果 编号 峰面积 保留时间 1892 4.107 2 1953 4.113 3 1595 4.118 4 1820 4.123 5 2040 4.142 6 1776 4.127 平均值 1846 4.122 RSD% 8.4 0.29 2.3线性范围考察 本文配制储备液浓度为1200 mg/L, 用甲醇对比稀释至约1 ng/mL。选取1.14、2.28、4.56、9.12、18.2、36.5、73和146 ng/mL标准工作溶液上机测定。使用外标法拟合工作曲线,加权方式为 1/C, NDMA在1.14-146 ng/mL范围内线性良好,相关系数大于0.999。曲线各标点浓度回读值精确度在 86.95-112.32%之间。详细结果见表3和图3. 表3NDMA线性范围(1.14-146 ng/mL) # Flags Data Filename Sample Type Cal Point Level A Found RT Conc. (ppb) Area S/N Accuracy(9) 'Standard'. Y 区 1 5UL-MEOH-NDMA STD-1.14 PPb23 Standard 1 4.087 1.05301 994 12.87 92.32 2 5UL-MEOH-NDMA STD-2.28 PPb Standard 2 4.092 1.98357 1744 38.12 86.95 3 5UL-MEOH-NDMA STD-4.56 PPb Standard 3 4.088 4.60631 3859 38.85 100.96 回4 5UL-MEOH-NDMA STD-9.125 PPb Standard 4 4.117 10.03077 8232 72.80 109.93 回5 5UL-MEOH-NDMA STD-18.25 PPb Standard 5 4.104 20.49777 16670 137.86 112.32 回6 5UL-MEOH-NDMA STD-36.5 PPb Standard 6 4.108 36.13136 29274 366.06 98.99 07 5UL-MEOH-NDMA STD-73 PPb Standard 7 4.109 73.30724 59244 449.45 100.42 8 5UL-MEOH-NDMA STD-146 PPb Standard 4.101 143.24934 115630 1362.95 98.12 图3 NDMA工作曲线 2.4加标回收率及重复性考察 精密称取含 NDMA 3.3 ppb 折算为 0.11 ppm 含量的样品,按照1.4进行前处理,加入适量 NMDA标准溶液进行三个浓度水平加标回收率考察。每个浓度平行制备三份样品,进行重复性考察。低中高三个加标浓度分别为 0.087、0.109和0.13 ppm。未加标样品谱图和0.109 ppm加标样谱图见图4。三水平加标回收率及重复性结果见表4。 图4实际样品谱图(左)和加标回收样品谱图(右) 表4三水平加标回收率及重复性计算结果((n=3) No. 样品本底值 (ppm) 0.087 ppm 加标结果 0.109 ppm 加标结果 0.13 ppm加标结果 实测值 回收率(%) 实测值 回收率(%) 实测值 回收率(%) (ppm) (ppm) (ppm) 1 0.187 100.0 0.192 84.4 0.222 93.8 2 0.1 0.171 81.6 0.197 89.0 0.217 90.0 3 0.176 87.4 0.199 90.8 0.217 90.0 平均值 0.178 89.7 0.196 88.1 0.219 91.5 CV% 4.58 1.74 1.37 2.5.供试品测定结果 6份供试品按照1.4所述方法制备上机测定。典型色谱图见图5所示。外标法计算样品含量,根据样品制备过程折算出雷尼替丁原料药中 NDMA的含量如表5所示。结果均小于法规要求的 0.32 ppm。 表5供试品中NDMA含量测定结果 样品编号 NDMA含量 (ppm) 0.13 2 0.11 3 0.03 4 0.04 5 ND 6 ND 图5雷尼替丁原料药中 NDMA检测谱图(4号与2号样品) |结论 本文利用岛津LCMS-9030高分辨质谱定量测定了盐酸雷尼替丁中的 NDMA。实验结果表明连续六次1ng/mL标准溶液的 S/N 均大于10, 1ng/mL适用于本法的定量限。2 ng/mL标准溶液连续进样6次,峰面积重复性<10%。在1.14-146ng/mL 浓度范围内,方法线性良好,相关系数>0.999。曲线各点点浓度计算结果回读值准确度在 86.95-112.32%之间。该法灵敏准确,稳定性好,适合此类药物基因毒性杂质的检测。 Shimadzu(China)CO.,LTD. Analytical Applications Center 系统适用性实验结果表明连续六次1 ng/mL标准溶液的S/N均大于10,1 ng/mL为本法的定量检出限。2 ng/mL标准溶液连续进样6次,峰面积重复性<10%。在1.14-146 ng/mL浓度范围内,方法线性良好,相关系数>0.999。曲线各标点浓度计算结果回读值在86.95-112.32之间,均满足法规要求。
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