人血浆中毒物快速筛查定性分析检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA19-106Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-402 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline：021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai CLAM-2030-LCMS-8050CL联用系统结合岛津“药物毒物快速筛查方法包'”对血浆样品中毒物进行全自动化快速筛查、定性分析 LCMSMS-402 摘要：本文基于 CLAM-2030-LCMS-8050CL联用系统结合岛津“药物毒物快速筛查方法包”(Ver.2)，将血浆样品用 CLAM-2030 自动前处理装置处理，以岛津超高效液相色谱仪LC-30A 和三重四极杆质谱LCMS-8050CL联用系统进行分析，实现了血浆样品中毒品的全自动化前处理以及快速筛查定性，样品前处理与分析可在20 min 内完成。八种加标物质阿普唑仑(Alprazolam)、苯丙胺 (Amphetamine)、苯甲酰胺康宁 (Benzoylecgonine)、艾司唑仑 (Estazolam)、氯胺酮 (Ketamine)、摇头丸(MDMA)、冰毒(Methamphetamine)、咪达唑仑(Midazolam)均被筛查出；依据 MRM 同时触发产物离子扫描结果进行二级质谱库搜索，结果显示八种检出物的匹配度均在70%及以上，表明筛查结果可靠性良好。 关键词： CLAM-2030药物毒物快速筛查方法包三重四极杆质谱血浆样品 当前药物滥用和非法使用毒品已成为一个严重的社会问题，血液是涉毒案件中常用的一种生物检材，其中毒物药物的准确检测是确认涉毒案件的科学依据。血液组成复杂，干扰成分多，分析血液基质中的毒品必须进行一定的样品前处理。蛋白沉淀是一种常见的前处理方法，但人工操作繁琐、费时、费力，且涉毒血液中的未知成分可能对操作人员造成潜在的生物危害。因此开发全自动化、快速且生物安全性高的前处理方式具有重要意义。为此岛津公司CLAM-2030 自动前处理装置应运而生，针对尿液、血液等样品中的毒物、兴奋剂等违禁药物可全自动进行蛋白质沉淀制备样品，整个处理过程在密闭的环境中进行，可有效避免污染，降低操作者的感染风险。样品处理结束无需人为操作， 由机械臂自动转移至液质联用系统进行分析，这个分析过程完全自动化，平行性好，大量节省人力物力。 同时针对当前刑侦、法医、毒理等相关领域通常需要分析的化合物，岛津公司又适时推出“药物毒物快速筛查”方法包，无需准备标准样品，即可进行161种药物、毒物的同时筛查、定性分析。本文利用岛津CLAM-2030 自动前处理装置，结合岛津“药物毒物快速筛查方法包”(Ver.2)，使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱 LCMS-8050 CL联用，实现了血浆样品中八种毒物的全自动化前处理、快速筛查、定性分析。方法具有样品前处理完全自动化、分析速度快、筛查结果可靠的特点，可为司法刑侦领域人员提供参考。 1.1仪器 本实验使用岛津CLAM-2030自动前处理装置及超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆杆谱仪LCMS-8050 CL联用系统。具体配置为 LC-30AD×2输液泵， DGU-20A，在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-30AC柱温箱，CBM-20A系统控制器，LCMS-8050 CL三重四极杆质谱仪配ESI离子源，LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站。 图1岛津CLAM-2030-LCMS-8050 CL 联用系统 1.2分析条件 液相条件 参考“药物毒物快速筛查方法包”((Ver. 2) 柱温：40℃ 进样量：3uL 洗脱方式：梯度洗脱，参考“药物毒物快速筛查方法包” (Ver. 2) 质谱条件 离子化模式：ESI碰並撞 气：：氩气加热气：：空气10.0 L/min接口温度：300℃雾化气：：氮气3.0 L/minDL温度：：2250℃干燥气：气气10.0L/min加热模块温度：400℃ 扫描模式：多反应监测(MRM) MRM参数：见方法包 1.3样品前处理方法 在CLAM-2030工作站界面优化自动前处理参数、蛋白沉淀剂使用量、震摇转速、震摇时间、抽滤时间等。确定样品自动前处理程序具体操作为(1)、吸取10 uL甲醇活化过滤管，准备上样； (2)、吸取血浆样品20uL上样； (3)、吸取沉淀剂40 uL 至过滤管进行沉淀蛋白； (4)、转速2400 rpm震摇90秒； (5)、使用-50~-60 kPa 的负压抽滤过滤管120s使溶液进入接收管； (6)、吸取 10 uL水进行稀释； (7)、转速2400 rpm震摇90秒； (8)、接收管转移至液相自动进样器，进样3uL。 分析结果 2.1样品前处理流程 岛津 CLAM-2030-LCMS-8050 CL联用系统可以实现并行前处理，即在一个样品自动前处理时，系统会根据前处理程序，同时自动开始下一个样品的前处理，并可以多个样品同时处理(见图2)，大大缩短了前处理时间，若实验单个样品前处理时间为6 min，质谱分析时间为5 min， 并行前处理功能使样品在线自动前处理与液质分析时间重叠，从在线自动前处理到液质分析完成仅需6min， 大大节省分析时间，优化仪器的使用和样品通量。本实验样品前处理时间为4 min，质谱分析时间为15 min。 图2 CLAM-2030并行前处理示意图 2.2样品筛查结果 方法包中提供了完整的液质分析解决方案：1)方法包中包含的方法文件列出了了谱分析条件，液相色谱分析条件，各化合物保留时间信息，报告文件等，由于这些分析方法已在实验室验证，因此可显著减少分析方法开发所需的时间；2)方法包中包含经过优化后的各化合物质谱分析参数，可大幅度减少参数优化所需的时间和精力；3)使用与方法包完全一致的分析参数，无需使用标准品，即可实现对样品的快速定性筛查。实际工作中实验人员用CLAM-2030自动前处理装置处理好样品后，只需按方法包中列出条件简单准备流动相、色谱柱等实验条件即可快速启动分析工作。 参照“药物毒物快速筛查方法包”中的方法MRM_Rapid Tox Screening_Ver2.lcm 对样品按照上述1.3的前处理方法处理后进样分析，阿普唑仑 (Alprazolam)、苯丙胺 (Amphetamine)、苯甲酰胺康宁 (Benzoylecgonine)、艾司唑仑(Estazolam)、、氯胺酮 (Ketamine)、摇头丸(MDMA)、冰毒(Methamphetamine)、咪达唑仑(Midazolam) 均被筛查出。MRM 色谱图如图3所示。 图3检出化合物 MRM 色谱图 2.3谱库搜索结果 方法包提供优化后的同步检查扫描参数以用于筛查分析：通过方法包中的二级质谱数据库，，可以对产物离子扫描结果进行相似度检索，进一步对疑似阳性化合物进行定性确证，确保检查结果的准确性。本应用案例中，采用的“SSS_Rapid Tox Screening_Ver2.lcm”方法中包含触发产物离子扫描功能，当超过设定的筛查扫描阈值时，同步筛查扫描功能启动，可自动对检出化合物进行产物离子扫描，得到检出物的二级质谱并进行谱库搜索，得到匹配度，根据匹配度可对检出物进行进一步定性。本次分析得到的匹配度结果和搜库结果分别如表1和图4所示(图4以氯胺酮 (Ketamine)为例，说明了搜库结果构成)。八种检出物的匹配度结果均在70%及以上，说明得到的筛查结果可靠性良好。 表1各个检出物搜库匹配度结果 编号 化合物 匹配度 阿普唑仑 78 2 苯丙胺 92 3 苯甲酰爱康宁 79 4 艾司唑仑 73 5 氯胺酮 86 6 摇头丸 80 冰毒 95 8 咪达唑仑 75 图4 Ketamine二级质谱图(上)与库中二级质谱图(下)匹配情况 2.4精密度结果 表2各个检出物(1.25ng/mL) 精密度结果表 编号 化合物 保留时间RSD%(n=6) 峰面积RSD%(n=6) 1 阿普唑仑 0.1 7.0 2 苯丙胺 0.3 3.0 3 苯甲酰爱康宁 0.2 5.5 4 艾司唑仑 0.1 7.5 5 氯胺酮 0.2 3.9 6 摇头丸 0.3 6.4 冰毒 0.3 4.3 8 咪达唑仑 0.1 7.0 结论 本文使用 CLAM-2030自动前处理装置，结合岛津‘“药物毒物快速筛查方法包”(Ver.2)，采用超高效液相色谱仪 LC-30A和三重四极杆质谱 LCMS-8050 CL联用系统，实现了血浆样品中药物毒物的全自动化前处理和快速筛查、定性分析。八种加标物质均被筛查出；依据二级质谱库搜索，得到所有检出物的匹配度均在70%及以上，且精密度良好，所有化合物的保留时间和峰面积稳定性均良好，表明筛查结果可靠性良好；在没有目标物标品的情况下得到了各个检出物的定性结果供相关人员参考。通过 CLAM-2030 全自动前处理装置 结合方法包，实现了样品前处理自动化，减少了有机试剂及生物样品对操作者造成的潜在感染风险及身体伤害，从样品处理到给出定性结果只需15分钟左右时间，大大提高了工作效率。 附录：方法包中包含化合物清单 本方法包中包含司法刑侦领域中常见的161种毒品及药物，通过 LabSolutions LCMS 软件，可在方法包中方法的基础上轻松自定义方法文件，增加或减少待分析目标化合物。并且该方法包中的分析参数列表可以用于针对待分析目标化合物创建特定的新方法文件。 1 7-Aminoclonazepam 55 Diltiazem 109 Milnacipran 2 7-Aminoflunitrazepam 56 Diphenhydramine 110 Mirtazapine 3 7-Aminonimetazepam 57 Diprophyline 111 Morphine 4 7-Aminonitrazepam 58 Diquat 112 Mosapramine 5 8-Hydroxyetizolam (M-III) 59 Donepezil 113 Nemonapride 6 9-Hydroxyrisperidone 60 Dosulepin 114 Nicotine 7 Acetaminophen 61 Duloxetine 115 Nimetazepam 8 Acetylpheneturide 62 Ecgonine methyl ester 116 Nitrazepam 9 Aconitine 63 Ephedrine 117 Nortriptyline 10 Allylisopropylacetylurea 64 Escitalopram 118 Olanzapine 11 alpha-Hydroxyalprazolam 65 Estazolam 119 Oxazepam 12 alpha-Hydroxybrotizolam 66 Ethenzamide 120 Paliperidone 13 alpha-Hydroxymidazolam 67 Ethyl loflazepate 121 Paroxetine 14 alpha-Hydroxytriazolam 68 Etizolam 122 Pemoline 15 Alprazolam 69 Fenitrothion(MEP) 123 Pentazocine 16 Amitriptyline 70 Fludiazepam 124 Pentobarbital 17 Amobarbital 71 Flunitrazepam 125 Perospirone 18 Amoxapine 72 Flurazepam 126 Perphenazine 19 Amphetamine 73 Fluvoxamine 127 Phenobarbital 20 Aripiprazole 74 Gabapentin 128 Pimozide 21 Atropine 75 Glibenclamide 129 Pioglitazone 22 Barbital 76 Gliclazide 130 Primidone 23 Benzoyl ecgonine 77 Glimepiride 131 Promethazine 24 Biperiden 78 Haloperidol 132 Propericiazine 25 Blonanserin 79 Haloxazolam 133 Propofol 26 Bromazepam 80 Hydroxyzine 134 Quazepam 27 Bromocriptine 81 Ibuprofen 135 Quetiapine 28 Bromovalerylurea 82 Imipramine 136 Risperidone 29 Bromperidol 83 Ketamine 137 Ropivacaine LCMSMS-402 30 Brotizolam 84 Lamotrigine 138 Salicylic acid 31 Bupivacaine 85 Levetiracetam 139 Sertraline 32 Caffeine 86 Levomepromazine 140 Sildenafil 33 Carbamazepine 87 Lidocaine 141 Spiperone 34 Carpipramine 88 Lorazepam 142 Sulpiride 35 Chlordiazepoxide 89 Lormetazepam 143 Tadalafil 36 Chlorpheniramine 90 Loxoprofen 144 Tandospirone 37 Chlorpromazine 91 Malathion 145 lemazepam 38 Clobazam 92 Maprotiline 146 THC 39 Clocapramine 93 MDA 147 THC-COOH 40 Clomipramine 94 MDMA 148 Thiamylal 41 Clonazepam 95 Medazepam 149 Timiperone 42 Clotiazepam 96 Mefenamic acid 150 Tofisopam 43 Cloxazolam 97 Memantine 151 Topiramate 44 Clozapine 98 Mepivacaine 152 Trazodone 45 Cocaine 99 Mequitazine 153 Triazolam 46 Codeine 100 Metformin 154 Trihexyphenidyl 47 Colchicine 101 Methamphetamine 155 Vardenafil 48 Desipramine 102 Methomyl 156 Valproic Acid 49 Desmethylclotiazepam 103 Methylephedrine 157 Warfarin 50 Desmethyldiazepam 104 Methylphenidate 158 Zolpidem 51 Dextromethorphan 105 Mexazolam 159 Zopiclone 52 Diazepam 106 Mexiletine 160 Zopiclone-N-oxide 53 Diclofenac 107 Mianserin 161 Zotepine 54 Dihydrocodeine 108 Midazolam Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 此联用系统能在线自动处理样品且数据重复性好，消除手动操作生物样品带来的风险，非常大限度地减少操作人员与生物样本的接触，放入采血管、必要试剂和专用处理管，便可进行在线自动前处理，每个样品并行处理，以优化仪器的使用和样品通量，并且通过软件来管理试剂、校准曲线、控制样品和系统维护，确保系统的性能和可靠性，系统提供可视化的图表和数据，可实时提醒用户试剂量的减少或 QC 样品结果的变化等，是一种全自动化的分析系统，同时结合岛津数据库可快速准确筛查毒物分析。