猪肉、猪肝、猪肾、牛奶、鸡蛋中喹诺酮类兽药残留检测方案

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样品加标回收率实验结果(添加水平为4. 0ug/kg) 14种喹诺酮类药物的残留检测 背景 养殖环节用药不当是造成兽药残留的最主要原因，尽管我国农业部对养殖方法有明文规定，但是总有养殖户为了追求最大的经济效益，违背相关法律法规进行养殖，例如将禁用药物(盐酸克伦特罗)当作添加剂添加到猪饲料中，从而引起瘦肉精中毒。兽药残留产生的危害会影响很多方面，最主要的是会在人体内蓄存以致发生急慢性中毒；对于动物体而言，反复接触抗菌药物，其体内的敏感菌株会产生抗药性，使得常规药物在临床上的治疗效果越来越差；其次，接触了药物以后的动物，它们的粪便和尿液随着排泄会稳定的存在于在周围环境中，从而造成环境污染。 适用范围 本方法(参照GB/T21312-2007)适用于猪肉、猪肝、猪肾、牛奶、鸡蛋等动物源性食品中氟罗沙星、氧氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、奥比沙星、双氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、奥索利酸、萘啶酸、氟甲喹等14种种诺酮类兽药残留的检测。 实验步骤 1、试剂准备 甲醇(CH3OH)：色谱纯 乙腈(CH3CN)：色谱纯 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA)：色谱纯 甲酸(HCOOH)：色谱纯 水： GB/T 6682 规定的一级水 柠檬酸：分析纯 磷酸氢二钠：分析纯 1-1、仪器 1·高效液相色谱-串联质谱仪 2·电子天平：感量0.0001g 3·电子天平：感量0.01g 4.旋涡混合器 5·冷冻离心机 6·聚丙烯离心管 7·氮吹仪 8·固相萃取装置 1-2、溶液配制 5%甲醇水溶液：准确量取5 mL 的甲醇，倒入100 mL 的容量瓶中，用水溶液定容至刻度，摇匀。 0.2%甲酸水：取2mL的甲酸，加入1000mL量瓶瓶中，用水定容至刻度，摇匀。 0.1%甲酸水：取1mL的甲酸，加入1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。 0.1 mol/L 柠檬酸水溶液：准确称取21.01g柠檬酸，加入1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液：准确称取71.63g磷酸氢二钠，加入1000 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀 Mcllvaine缓冲溶液：将1000mL的0.1 mol/L 柠檬酸水溶液与 625 mL 的 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液混合，必要时用盐酸或者氢氧化钠调节 pH 为4.0±0.05。 0.1 mol/LEDTA-Mcllvaine 缓冲溶液：准确尔取60.5 g乙二胺四乙酸二钠，放入1625 mL 的 Mcllvaine 缓冲溶液中，摇晃混匀。 2、样品提取 牛奶和鸡蛋 称取均质试样5.0g(精确到0.01g)置于50mL离心管中，加入 40mL 0.1mol/L EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液，1000r/min 涡旋混合 1min， 超声提取10min， 10000r/min 离心 5min(温度低于5℃)，取上清液。 3、净化 SPE柱： SelectCore HLB 固相萃取柱(200mg/6mL) 活化：依次用6mL的甲醇和水活化； 上样：加入提取好的全部上清液； 淋洗：2mL5%甲醇水溶液进行淋洗，淋洗结束后再减压抽干； 洗脱： 6mL 甲醇溶液进行洗脱，洗脱液在40℃下用氮气吹干，用1mL0.2%甲酸水复溶后过 0.22um 有机滤膜，上机。 4、液相色谱仪器条件 色谱柱： ChromCoree CC18 3um，2.1×100mm 柱温：40℃ 进样体积：1pL 流速：0.4mL/min 流动相：A相：0.1%甲酸水溶液；B相：乙腈 洗脱梯度： 时间 (min) A% B% 流速(mL/min) 0.00 90 10 0.400 1.00 70 30 0.400 纳谱分析 4.00 30 70 0.400 6.00 0 100 0.400 8.00 0 100 0.400 8.10 90 10 0.400 12.00 90 10 0.400 5、质谱条件 离子源：电喷雾离子源 (Electrospray ionization， ESI) 正离子扫描 监测方式：多反应监测(Multiple Reaction Monitoring， MRM) 雾化气流量： 3L/min 加热器流量： 10L/min 干燥气流量： 10L/min 接口温度：300℃ DL温度：250℃ 加热块温度：400℃ 6、实验谱图 (x100，000)_ 图1： 10ng/mL14种喹诺酮类药物标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图 图2：空白样品里14种喹诺酮类残留量的多反应监测(MRM)色谱图 (x100，000) 图3：鸡蛋基质中添加量为 4.0ug/kg 14 种喹诺酮类药物标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图 样品名称 化合物(中文) 化合物(英文) 保留时间(min) m/z 加标量(pg/kg) 平均回收率% 1 依诺沙星 enoxacin 2.659 321.0>303.0 4.0 84.05 2 氟罗沙星 fleroxacin 2.865 369.9>326.0 4.0 105.06 3 诺氟沙星 norfloxacin 2.943 320.0>302.0 4.0 90.93 4 氧氟沙星 ofloxacin 2.957 362.1>318.2 4.0 90.67 5 环丙沙星 ciprofloxacin 3.080 331.9>314.0 4.0 88.76 6 达氟沙星 danofloxacin 3.233 357.9>340.0 4.0 81.96 7 恩诺沙星 enrofloxacin 3.307 360.0>342.1 4.0 93.79 8 奥比沙星 orbifloxacin 3.351 395.90>352.1 4.0 85.79 9 沙拉沙星 sarafloxacin 3.468 386.1>368.0 4.0 86.96 10 双氟沙星 difloxacin 3.493 399.9>355.9 4.0 109.01 11 司帕沙星 sparfloxacin 3.507 393.0>349.2 4.0 105.15 12 噁喹酸 oxolinic acid 4.060 261.9>244.1 4.0 114.85 13 萘啶酸 nalidixic acid 4.589 232.9>215.0 4.0 93.26 14 氟甲喹 flumequin 4.697 261.9>243.9 4.0 108.13 7、实验结论 由以上数据和图谱可知，纳谱分析 SelectCore HLB 小柱能有效去除杂质的干扰，对目标物质有良好的保留和洗脱能力，回收率也较好，符合国标动物源性食品中14种喹诺酮类兽药残留的检测要求。 纳谱分析NanoChrom纳谱分析技术(苏州)有限公司Phone： E-mail： customerservice@nanochrom.com Web： www.nanochrom.com 样品名称化合物（中文）化合物（英文）保留时间（min）m/z加标量（μg/kg）平均回收率%1依诺沙星enoxacin2.659321.0>303.04.084.052氟罗沙星fleroxacin2.865369.9>326.04.0105.063诺氟沙星norfloxacin2.943320.0>302.04.090.934氧氟沙星ofloxacin2.957362.1>318.24.090.675环丙沙星ciprofloxacin3.080331.9>314.04.088.766达氟沙星danofloxacin3.233357.9>340.04.081.967恩诺沙星enrofloxacin3.307360.0>342.14.093.798奥比沙星orbifloxacin3.351395.90>352.14.085.799沙拉沙星sarafloxacin3.468386.1>368.04.086.9610双氟沙星difloxacin3.493399.9>355.94.0109.0111司帕沙星sparfloxacin3.507393.0>349.24.0105.1512噁喹酸oxolinic acid4.060261.9>244.14.0114.8513萘啶酸nalidixic acid4.589232.9>215.04.093.2614氟甲喹flumequin4.697261.9>243.94.0108.13