PD-L1 单抗中质量控制检测方案(图像粒度粒形)

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药物分析杂志Chin J Pharm Anal 2019，39(1)·13· 抗 PD-L1单抗的质量控制研究” 郭莎，王开芹，武刚，李萌，崔永霏，俞小娟，张荣建，于传飞，王兰** (中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定方法及标准化重点实验室，北京102629) 摘要目的：研究建立抗程序性死亡受体配体1( programmed cell death protein ligand 1， PD-L1)单抗的质量控制方法。方法：利用成像毛细管等电聚焦电泳( imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis，iCIEF)、肽图对抗PD-L1单抗进行鉴别；利用还原/非还原十二烷基磺酸钠毛细管电泳(capillaryelectrophoresis-sodium dodecyl sulfonate， CE-SDS)分子排阻高效液相色谱( size exclusion-high performanceliquid chromatography， SEC-HPLC)离子交换高效液相色谱(ion exchange-high performance liquid chromatography，IEC-HPLC)对抗 PD-L1单抗的纯度进行控制；利用细胞结合抑制法和转基因细胞法测定抗 PD-L1单抗的活性；利用光阻法和液流成像分析法对不溶性微粒进行检测和分析。结果：抗PD-L1单抗的 iCIEF检测结果具有特征性主峰，肽图检测具有相应特征峰，起到很好的鉴别作用。还原 CE-SDS 的轻链与重链峰面积之和的百分比为(98.37±0.21)%，非还原 CE-SDS 主峰峰面积百分比为(96.33±0.15)%；SEC-HPLC 单体的峰面积百分比为(99.43±0.02)%； IEC-HPLC 酸性区峰面积百分比、主峰峰面积百分比、碱性区峰面积百分比分别为(13.63±0.40)%、(80.00±0.36)%、(6.37±0.15)%。细胞结合抑制法与转基因细胞法的活性检测均呈现剂量反应曲线，反映抗 PD-L1 单抗剂量依赖性地阻断程序性死亡受体1(programmed celldeath protein 1，PD-1 )与 PD-L1 的结合及后续的生物学效应。光阻法检测≥10 pm 及≥25 pum的不溶性微粒数分别为(1.33±0.58)粒·mL和(0.00±0.00)粒·mL；液流成像分析法检测 2~10 pm、≥ 10 pm及≥25 p.m的微粒数分别为(1243.67±242)粒·mL、(45.67±16.07)粒·mL和(10.00±5.00)粒·mL，其中，蛋白聚体占 87.45%，非蛋白聚体占 12.55%。结论：研究建立了抗 PD-L1 单抗的多种质控方法，为国内抗 PD-L1 单抗的质量检测提供了参考依据。 关键词：抗程序性死亡受体配体1单抗；转基因细胞法；生物学活性；鉴别；纯度测定 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793(2019)01-0013-10 doi：10.16155/j.0254-1793.2019.01.02 Study on quality control of anti-PD-L1 monoclonal antibody GUO Sha， WANG Kai-qin， WU Gang， LI Meng， CUI Yong-fei， YU Xiao-juan，ZHANG Rong-jian， YU Chuan-fei， WANG La*n* (Division of Monoclonal Antibody， National Institutes for Food and Drug Control， Key Laboratory of the Ministry ofHealth for Research on Quality and Standardization of Biotech Products， Beijing 102629， China ) Abstract(Objective： To investigate and establish quality control methods for anti-programmed cell death ( * 国家科技重大专项重大新药创制项目免疫检查点单抗和其他创新生物技术药的质量评价方法和标准研究(2018ZX09101001-003) ) ( ** 通信作者 Tel：( 0 10) 5 3852159；E-mail： wanglan@nifdc.org.c n ) ( 第一作者 Tel：( 010)53852177； E-mail： guosha@nifdc.org.cn ) ( 药物分析杂 志 ) protein ligand 1(PD-L1) monoclonal antibody (mAb). Methods：Imaging capillary isoelectric focusingelectrophoresis(iCIEF)and peptide mapping were used for identification of the anti-PD-L1 mAb. The purity wasmeasured using mothods including reduced/non-reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate ( CE-SDS )， size exclusion-high performance liquid chromatography( SEC-HPLC) and ion exchange-high performanceliquid chromatography(IEC-HPLC). The activity of anti-PD-L1 mAb was determined by cell binding inhibitionmethod and transgenic cell method， and the sub-visible particles were detected and analyzed by light obscurationand flow imaging method. Results： The iCIEF and peptide mapping data showed the characteristic peaks of anti-PD-L1 mAb， which played a promising role in product identification. The area percentage of the sum of bothlight chain and heavy chain was (98.37±0.21)%，as detected by reduced CE-SDS assay； the area percentage ofthe main peak detected by non-reduced CE-SDS was (96.33±0.15)%. The area percentage of monomer peakdetected by SEC-HPLC was(99.43±0.02)%. The area percentage of the acid peak， the main peak and the basicpeak were( 13.63±0.40)%，(80.00±0.36)%and(6.37±0.15)%， respectively. In bio-specific activity assays，both cell binding inhibition method and transgenic cell method assays showed dose-response curves， reflectingdose-dependent blockade of the binding between PD-L1 and programmed cell death protein 1(PD-1)， as wellas the subsequent anti-PD-L1 mAb-induced biological effect. The detected amount of sub-visible particles withdiameters of ≥ 10 um，≥ 25 um by light obscuration were( 1.33±0.58)particle·mL and(0.00±0.00)particlemL， respectively； the detected amount of sub-visible particles with diameters of 2-10 um，≥ 10umand≥ 25 pm by flow imaging method were( 1 243.67±242)particlemL ，(45.67±16.07 )particle ·mLaand(10.00±5.00) particle·mL，respectively，in which 87.45% were protein aggregates while 12.55% were non-protein particles. Conclusion： A series of representive quality control methods for anti-PD-L1 mAb have beenestablished， which can provide references for the quality control of anti-PD-L1 mAb in China. Keywords：anti-PD-L1 mAb； transgenic cell method； biological activity； identification； purity determination 与正常细胞相比，肿瘤细胞有诸多遗传学和表观遗传学的改变，这些改变产生大量宿主免疫系统能够识别的肿瘤相关抗原，具有较强的免疫原性，然而，免疫系统对肿瘤细胞的主动清除有时并不奏效，其中-个重要原因是免疫耐受。肿瘤细胞可能利用免疫系统的一系列抑制途径(即免疫检查点)介导免疫耐受，尤其是T细胞介导的针对肿瘤抗原的特异性免疫的免疫耐受_2-3J。这一领域的研究早在10年前便已开展，近期在治疗肿留方面也显示了巨大的潜力，迅速成为生物制药企业研发的热点。 PD-1/PD-L1分子是目前免疫检查点领域倍受关注的靶点4。与细胞毒T淋巴细胞相关抗原4( cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4， CTLA4)表达在初始T细胞表面不同， PD-1分子在外周T细胞上的表达需要T细胞活化的诱导。在肿瘤微环境中，除了少数肿瘤细胞组成性表达PD-L1，绝大部分肿瘤细胞上 PD-L1 的表达需要T细胞受体(T cellreceptor， TCR)与肿瘤细胞表面抗原结合后所释放 的干扰素 y(interferon， IFN-y)的诱导。PD-L1与PD-1 或白细胞分化抗原80(cluster of differentiation80， CD80)结合后，PD-L1可以通过诱导效应T细胞免疫无能、凋亡、白介素 10(interleukin-10，IL-10)分泌以及调节性Ｔ细胞( regulatory T cell，Treg)分化等多种机制介导免疫耐受2，5-81。抗 PD-L1抗体能够打破免疫耐受，起到有效的抗肿瘤作用19-13。截止2017年底，美国食品药品监督管理局(Food and DrugAdministration， FDA)批准了3个PD-L1抗体，分别为罗氏的 Atezolizumab、阿斯利康的 Durvalumab 和辉瑞/默沙东的 Avelumab， 适应症包括非小细胞肺癌、尿路上皮癌以及 merkel 细胞癌等少见癌种_14-18]；国内也有10多家药企布局了该靶点抗体的研发，但抗PD-L1抗体尚未发展到上市申请阶段。 根据对抗 PD-L1单抗作用机制的不同认知和差异化的研发策略，目前抗 PD-L1单抗有不同类别，如去糖基化改造的 IgG1、IgG4以及保留糖基化的IgG1。本研究以去糖基化改造的 IgG1 型抗 PD-L1 单抗为目标产品，根据产品特征及关键质量属性，结合iCIEF、肽图、CE-SDS、SEC-HPLC、IEC-HPLC、生物学活性等，对抗 PD-L1单抗的质控分析方法进行探讨，为PD-L1的质量控制提供参考。 1材料与方法 1.1 供试品 抗 PD-L1人源化单抗的参比品和样品均为中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室留样。 1.2 细胞 CHO 和 Jurkat细胞系均购自ATCC公司。表达PD-L1的 CHO-K1 细胞系(CHO-K1/PD-L1)转染 PD-L1与膜型抗 CD3单链抗体的 CHO 细胞系(CHO/PD-L1-CD3L)稳定转染 PD-1与 NFAT反应元件控制下的荧光素酶基因的 Jurkat 细胞系(Jurkat/PD-1-NFAT)由中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室保存、传代。 1.3 试剂材料 载体两性电解质 Pharmalyte 3-10及8-10.5购自GE Healthcare 公司；iCE280试剂盒(包括1%甲基纤维素，阳极及阴极电解液)涂层毛细管、pI Markers 均购自 ProteinSimple公司。胰蛋白酶购自 Promega 公司； AdvanceBio Peptide Map( 4.6 mm×150 mm， 2.7um)购 自 Agilent 公司。SDS-MW分析试剂盒(含有0.1 mol·L氢氧化钠，0.1 mol·L盐酸，SDS样品缓冲液，SDS-MWGel Buffer)、毛田管(50 um×65 cm)均购自Beckman Coulter 公司， TSK G3000SWXL 色谱柱(300mmx7.8mm，5pm)购自 Tosoh 公司， DionexProPacWCX-10色谱柱(250mm×4mm)购自 Thermo公司。F-12K 基础培养基购自 Invitrogen 公司，胎牛血清购自 Gibco 公司，带鼠可结晶片段的PD-1(PD-1-mFc)为中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室保存； MSD 高结合96孔板、Ru(bpy)标记的羊抗鼠抗体、4xRead Buffer 均购自 Meso Scale Discovery 公司。潮霉素B购自Roche 公司，嘌呤霉素购自 Sigma 公司；RPMI1640、DMEM/F12、PBS、NEAA 均购自 Gibco 公司；Bio-GloTM荧光素酶检测试剂盒购自 Promega 公司。 1.4 主要仪器 iCE280(ProteinSimple公司)；1260高效液相色谱系统( Agilent公司)。PA800 plus 系统、PDA检测器( Beckman Coulter 公司)。2695高效液相色谱仪(Waters公司)。 SECTOR S 600 超敏多因子电化学发光分析仪(Meso Scale Discovery 公司)； SPECTRAM5酶标仪(Molecular device公司)。 GWJ-8型微粒检测 仪(天津天大天发公司)；FlowCAM 8100 流体颗粒成像分析系统(Fluid Imaging 公司)。 1.5 方法 1.5.1 鉴别 1.5.1.1 iCIEF 将样品用纯水稀释至2 mg'mL，将50 pL样品溶液与70 pL 1%甲基纤维素混合，再加入0.5 uL pI marker 7.05、0.5 uL pI marker 9.50、8.0pL Pharmalytes 3-10、2.0 pL Pharmalytes 8-10.5，最后添加43% 尿素溶液69 pL，混匀，6500 rmin离心3 min。分析条件：预聚焦电压1.5 kV，持续1 min；聚焦电压3kV，持续10 min。 1.5.1.2 肽图 取0.5 mg样品(以单抗蛋白量计)，加入 1 mol·L二硫苏糖醇5 pL，100 mmol·L碳酸氢铵安液100uL，混匀后置于95℃水浴 15 min，取出后加入尿素300 uL， 10 kD 离心管超滤。加入100mmol·L乙酰胺200 pL，室温避光孵育 30 min，置换至200 pL25 mmol·L碳酸氢铵缓冲液中，按体积比12：1加入0.5 mg'mL胰酶混匀，37℃水浴酶切20h后，加入20 uL 5%TFA 终止反应。采用Agilent 1260 高效液相色谱系统， AdvanceBio PeptideMap 色谱柱分离。检测条件：流动相A为0.1%的三氟乙酸-水溶液，流动相B为0.1%的三氟乙酸-乙腈溶液，梯度洗脱(0~65 min，流动相B从2%上升至95%；65.1~75 min，流动相B从95%降低至2%)，流速0.5 mL·min，上样量10 ug，样品室温度8℃，柱温50℃，检测波长214 nm。 1.5.2 纯度 1.5.2.1 CE-SDS用超纯水将样品稀释至3.0 mg'mL，取该溶液25pL，加入巯基乙醇(还原)/0.1 mol·LN-乙基马来酰亚胺(非还原)5 uL， SDS样品缓冲液75 pL，混匀后，70℃水浴 10 min，取80 uL置进样瓶中后上机分析。采用 Beckman PA800 plus 毛细管电泳系统，使用无涂层毛细管(内径50 um，总长度31cm，有效长度21cm)检测。检测条件：分离电压为15kV，毛细管温度30℃，样品室温度为15℃，检测波长为 220 nm。计算样品轻链峰+重链峰(还原型)或主峰(非还原型)峰面积百分比。 1.5.2.2 SEC-HPLC 将样品用流动相(50mmol·L磷酸钾-300 mmol·L氯化钠溶液)稀释至10.0mg'mL-， 采用 Waters 2695 HPLC 系统、2489紫外检测器、TSK G3000SWXL 色谱柱进行检测。检测条件：流动相为50 mmol·L-磷酸钾-300 mmol·L氯 化钠，流速1.0 mL·min，上样量10 pL，进样器温度5℃，柱温25℃，在280 nm 处检测。采用面积归一化法计算单体百分比。 1.5.2.3 IEC-HPLC 用超纯水将样品稀释至1.0mgmL，采用 Waters 2695 HPLC 系统、2489紫外检测器、Dionex ProPacWCX-10 色谱柱检测。检测条件：流动相A为10 mmol.L磷酸盐(pH6.5)，流动相B为10 mmol·L磷酸盐-500mmol·L氯化钠(pH6.5)，梯度洗脱(0min，流动相B为8%；0~30 min，流动相B上升至100%；30~60 min，流动相B维持在100%；40~60 min，流动相B为8%)，流速1mL·min，上样量100 uL，样品温度2~8℃，柱温35℃，检测波长280nm，检测时间60 min。采用面积归一化法计算主峰、酸性区域和碱性区域峰面积百分比。 1.5.3 生物学活性测定 1.5.3.1 细胞结合抑制法 将150 pL封闭液(含15% 胎牛血清的F-12K培养基)加入到高结合96孔石墨电极板中，于振荡器上以200 rmin 的转速室温振荡2h。将样品用分析培养基(含10%胎牛血清的F-12K 培养基)进行梯度稀释，然后分别与一定浓度的PD-1-mFc 和Ru(bpy)3标记的羊抗鼠抗体混合后转移至96孔板中，2~8℃冰箱避光保存。复苏 CHO-K1/PD-L1 细胞，用分析培养基重悬，以每孔5000个细胞加入到已封闭的高结合96孔板中，并将96孔板中的混合液加入，总体积为100 uL，样品终浓度梯度在0~4000 ngmL之间，室温避光孵育1h。将4×读数缓冲液(Read Buffer ) 与杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’sphosphate buffered saline， DPBS )以1：1的比例制备成2×Read Buffer，以每孔 100 pL加入 MSD高结合96孔板中，用 MSD MESOTM SECTOR S600 读板。 1.5.3.2 转基因细胞法Jurkat/PD-1-NFAT细胞复苏后于含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸(non-essentialamino acid， NEAA )、0.4 mgmL潮霉素B、4pgmL嘌呤霉素的 RPMI 1640的培养基中37℃、5%CO培养。CHO/PD-L1-CD3L 细胞复苏后于10%胎牛血清、1%NEAA、0.2 mg*mL潮霉素B、8pg'mL嘌呤霉素的DMEM/F12培养基中37℃、5% CO培养。2~3d传代1次。以每孔50000个细胞的密度将 CHO/PD-L1-CD3L 接种于白色96孔板中，并于37℃、5%CO，孵箱中孵育12~14h。去除培养基，将于50 uL测试培养基(含2%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基)中的100000个 Jurkat/PD-1-NFAT 添加至各孔中。抗 PD-L1抗 体以100 ugmL 为冶始点，用测试培养基按1：3进行倍比稀释后，以每孔50 p.L 加入各孔，每个浓度点设置双复孔。之后将96孔板于37℃、5%CO，孵箱中孵育6h。每孔添加100 uL发光底物，并在SPECTRAM5 酶标仪上采用化学发光模式进行读数。 1.5.4 不溶性微粒检测 不溶性微粒检测采用光阻法和液流成像分析法2种方法。光阻法按2015年版《中华人民共和国药典》检测并报告≥10 um、≥ 25 pm 的微粒数。液流成像分析法采用 Fluid imaging 公司的 FlowCAM 8100 流体颗粒成像分析系统检测。系统主要参数设定如下：设定比背景亮及比背景暗15个像素的“物”均被有效拍照，上样量500 uL，测试流速为 0.1 mL·min，拍照频率为每秒22帧；样品间采用超纯水以 3 mL·min流速清洗5~10次，以减小样品间互相干扰；结果报告2~10um、≥ 10 pm、≥ 25 um 的微粒数及微粒的组成。 2结果 2.1 鉴别 2.1.1 iCIEF 参比品与样品的 iCIEF 代表性图谱见图1。目视观察，样品与参比品图谱无明显差异，均有1个主峰。按照线性回归方式将pI标准品(pI7.05、9.50)拟合标准曲线，用以计算主峰pI，参比品主峰 pI 为 8.556，样品主峰pI 为 8.560，样品主峰pI与参比品主峰pI的差值≤0.2，认为样品主峰与参比品一致。积分结果显示，参比品酸性峰、主峰、碱性峰百分比分别为 25.79%、70.48%、3.73%，样品酸性峰、主峰、碱性峰百分比分别为 25.93%、70.27%、3.80%，可见样品与参比品酸碱变异体比例类似。 2.1.2 肽图 RP-HPLC肽图检测代表性图谱见图2。 目视观察，样品与参比品肽图谱无明显差异，均具有1个参比峰和4个特征色谱峰，参比峰保留时间在31.5~33.5 min 之间，4个特征色谱峰轻链-互补决定 区 3(light chain-complementarity determining region3， LC-CDR3)、重链-互补决定区3( heavy chain-complementarity determining region 3，HC-CDR3)、轻链-互补决定区 1(light chain-complementaritydetermining region 1，LC-CDR1)、重链-互补决定区2(heavy chain-complementarity determiningregion 2，HC-CDR2)与参比峰的相对保留时间均在0.73~0.79、1.05~1.11、1.07~1.13、1.11~1.17内。以上结果表明，样品的肽图图谱与参比品一致。 图2抗PD-L1单抗参比品(A)与样品(B)的肽图代表图谱 Fig.2Representative peptide mapping profiles of reference(A )and sample( B) of anti-PD-L1 mAb 2.2 纯度 2.2.2 SEC-HPLC 2.2.1 还原/非还原型 CE-SDS 还原 CE-SDS 检测结果表明(图3-A)，样品轻链+重链的峰面积百分比为(98.37±0.21)%， RSD 为 0.21%(n=3)。非还原 CE-SDS 检测结果表明(图3-B)，样品主峰峰面积百分比为(96.33±0.15)%，RSD 为 0.16%(n=3)。 SEC-HPLC 检测结果见图4，10 mgmL样品溶液上样100uL时，样品中单体的峰面积百分比为(99.43±0.02)%， RSD 为 0.02%；聚体的峰面积百分比为(0.43±0.01)%， RSD 为3.20%(n=3)。 图4抗PD-L1单抗样品的 SEC-HPLC代表图谱 Fig.4 Representative SEC-HPLC profile of anti-PD-L1 mAb 2.2.3IIEC-HPLC 图3抗 PD-L1单抗样品的还原(A)和非还原(B)CE-SDS 代表图谱 Fig. 3Representative profiles of reduced(A ) and non-reduced(B )CE-SDS for anti-PD-L1 mAb samples IEC-HPLC 色谱图见图5，样品中酸性峰峰面积百分比为(13.63±0.40)%， RSD 为 2.96%；主峰峰面积百分比为(80.00±0.36)%，RSD 为 0.45%；碱性区峰面积百分比为(6.37±0.15)%， RSD 为 2.40%(n=3)。 图5抗 PD-L1 单抗样品的IEC-HPLC 代表图谱 Fig.5IIEC-HPLC representative profiles of anti-PD-L1 mAb samples 2.3 生物学活性 2.3.1 细胞结合抑制法 细胞结合抑制法采用电化学发光(electro-chemiluminescence，ECL)原理191，以抗 PD-L1单抗 抑制带 Ru(bpy)标记的游离 PD-1 与表达 PD-L1的 CHO-K1细胞结合的原理来检测其阻断活性(图6)。检测结果(图7-A)显示，反应曲线呈典型的S型，符合四参数方程Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D. 拟合方程中，A为上渐近线值，即当抗 PD-L1单抗浓度为0时，对游离PD-1与 CHO-K1/PD-L1的结合无抑制时的化学发光值；D为下渐近线值，即游离PD-1与 CHO-K1/PD-L1的结合被抗PD-L1单抗完全抑制时的化学发光值；B为线性段斜率，即 随着 PD-L1 单抗浓度升高，游离 PD-1与 CHO-K1/PD-L1的结合被抑制后信号的下降幅度；C为半数有效剂量，即EC5o。与参比品比较，样品相对活性为(90.67±6.03)%， RSD 为6.65%(n=3)。 图66ECL 技术检测抗 PD-L1单抗活性的原理示意图( https：//www.mesoscale.com/en/technical_resources/our_technology/ecl) 转基因细胞法检测抗 PD-L1单抗活性的系统中包含CHO/PD-L1-CD3L 和 Jurkat/PD-1-NFAT2个细胞系，用以模拟 PD-1/PD-L1在体内真实的作用机制，进而评价抗 PD-1/PD-L1单抗的生物学活性，原 图7抗 PD-L1单抗样品的细胞结合抑制法(A)和转基因细胞法(B)活性检测结果 理见图8。从检测结果(图7-B)来看，抗 PD-L1单抗能剂量反应性地抑制两细胞间 PD-L1与 PD-1的结合，拟合优度R’达0.99。与参比品比较，样品相对生物学活性为(100.69±10.02)%，RSD 为 9.95%(n=3)。 2.4 不溶性微粒检测 不溶性微粒指粒径为1~100 um的流动性的、不溶解的污染颗粒，成分为蛋白聚体、硅油滴、纤维等。样品用光阻法检测，经3次测定，≥10 p.m及≥25 um的微粒数分别为(1.33±0.58)粒·mL和(0.00±0.00)粒·mL，符合2015年版《中华人民共和国药典》规定。用液流成像分析法检测，经3次测定，2~10 pm、≥ 10 pm 及≥ 25 pum 的微粒数分别为(1243.67±242)粒·mL、(45.67±16.07)粒·mL和(10.00±5.00)粒·mL；成分分析及代表图像见图9，可见在所有微粒中，蛋白聚体占87.45%，非蛋白聚体占 12.55%。 图9液流成像分析法检测抗 PD-L1单抗样品不溶性微粒的成分分析及代表图像 Fig. 9Component analysis and representative image of sub-visibleparticles in anti-PD-L1 mAb samples by liquid flow imaging analysis 3讨论 随着免疫学的发展和对病理机制的深入研究， 新的抗肿瘤靶点和作用机制不断出现，肿瘤免疫治疗领域不断拓展。抗 PD-L1单抗具有持续的抗肿瘤效果和可耐受的不良反应，是肿瘤治疗里程碑式的新手段，也是联合用药的候选药物，对其质控方法进行研究十分必要。 3.1 鉴别 等电点和肽图是单抗特征性的质量属性，因此，可作为鉴别项目。本文采用 iCIEF 对等电点进行控制，该方法分辨率高，操作简单，已被越来越多的企业所采用1211。不不但可以从等电点的角度对抗体进行鉴别，还可以从酸性峰、主峰、碱性峰的含量上进行控制和评价。肽图检测采用了对脱氨基、甲硫氨酸氧化、C-末端封闭和错误二硫键等结构改变敏感的胰酶肽图，通过与参比品比较，可见样品中无新峰出现，并使用相对保留时间对4个互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)特征峰进行控制，从而对抗 PD-L1单抗进行识别。2种方法的结合使用起到了鉴别作用。 3.2 纯度 单抗纯度多采用 CE 法和HPLC 法进行控制。非还原 CE-SDS 侧重检测不完整抗体；还原 CE-SDS侧重检测非糖基化重链、断裂片段等。由于重链的糖基化与抗体的Fc效应有关，而抗 PD-L1单抗发挥抗肿瘤作用主要依靠靠结合活性，而非Fc效应，因此，并未对非糖基化重链含量进行专门的控制，若抗 PD-L1单抗在设计时保留了 Fc 效应功能，则除了控制非糖基化重链含量，还需对寡糖图谱进行分析。SEC-HPLC 采用温和的条件对抗 PD-L1抗体进行分离，保持了抗体天然的状态，使得共价和非共价结合的聚体均能与单体进行有效分离，且本文中使用了较高的浓度进行检测，以便更加灵敏地发现聚体的存在。IEC-HPLC 主要用于检测样品中不同电荷异构体的比例，可与 iCIEF 结合起来应用，对酸性峰、主峰、碱性峰进行含量分析和控制，并可通过适当手段对各组分进行分离、鉴别以及对活性等功能进行评价。3种方法的结合应用，对该抗 PD-L1单抗纯度进行了有效控制，检测结果均符合质量标准的要求。 3.3 生物学活性 抗PD-L1单抗的活性检测包括结合活性和生物学活性2个方面，前者侧重于抗体与靶抗原的结 合，后者则侧重于抗体结合靶抗原后引起的生物学效应。本文采用了细胞结合抑制法对抗 PD-L1单抗与靶抗原的竞争结合进行检测，试验中使用CHO-K1/PD-L1 细胞，采用电化学发光技术，相交于传统的结合ELISA、竞争 ELISA 等评价方法而言，试验是在细胞上和均相环境中进行，更真实地反映了抗原抗体的结合状态。虽然对于抗 PD-L1 单抗来说，其主要作用机制有赖于与靶抗原的结合，但就其发挥抗肿瘤效应而言，结合活性并不足以对其进行阐释，故本文还采用了基于细胞的抗 PD-L1单抗生物学效应的检测手段。原理为当 CHO/PD-L1-CD3L 与 Jurkat/PD-1-NFAT细胞处在同一环境中，CHO细胞上的膜型抗 CD3 单链抗体与 Jurkat 细胞上的 CD3分子结合，提供T细胞激活的第一信号，同时会诱发 CHO细胞上 PD-L1与 Jurkat 细胞上PD-1结合，启动抑制信号，导致 Jurkat 细胞的免疫耐受，即无法转导第一信号和激活下游荧光素酶的表达。当抗 PD-1/PD-L1单抗存在时，能抑制 PD-1/PD-L1结合，使T细胞恢复激活状态，并引发下游信号转导。!与其他生物学效应检测方法，如T细胞增殖后细胞因子检测、T细胞表面标记物检测及混合淋巴细胞反应等相比，该方法克服了检测时间长，操作复杂，细胞状态变异较大等难点和不便，能够稳定、快速、特异地反映抗 PD-L1 单抗的生物学效应201，是单抗质量控制中非常关键的一个检测项目。 3.4 不溶性微粒 2015年版《中华人民共和国药典》三部通则0903 要求采用光阻法对不溶性微粒进行检测，该方法仅能对不溶性微粒进行计数，并不能分辨其性质。液流成像分析法通过拍照将不溶性微粒的图像拍摄和保存下来，该方法不但能分辨出与背景差别较小的透明或半透明微粒，大幅提高对蛋白颗粒的检测灵敏度，还能通过对图像进行参数分析进而判断颗粒是否为蛋白聚体，有助于对不溶性微粒的来源进行分析并进行有针对性的控制，这也使不溶性微粒的检测更有意义。 鉴于单抗产品的复杂性和多样性，应从生产工艺控制到质量属性分析以及稳定性评价等方面，不断积累对产品的认知，分阶段选择适宜的方法，建立有效的质量控制体系。我国研发的抗 PD-L1单抗均为新药，且各具特点，有人源化抗体，也有全人 源抗体；有IgG1型抗体，也有 IgG4型抗体；有保留Fc 功能的设计，也有将 Fc 改造以弱化抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)功能的策略，因此，质量控制手段也有差异，没有哪一种方法适用于所有产品。根据 ICHQ6B 建议，对药物的某一质量属性应建立2种或2种以上基于不同原理的检测方法，本文以去糖基化改造的人源化抗 PD-L1 IgG1抗体为例，采用多种方法对抗 PD-L1 单抗进行了鉴别，纯度分析，活性检测与不溶性微粒检测等，印证了多种方法交互应用在保证产品安全、有效、质量可控方面的必要性，为抗 PD-L1单抗的质量控制提供了参考。 ( 参考文献 ) ( [ 1 ] PARDOLL DM. The bl o ckade of immune ch e ckpoints in cancer i mmunotherapy [J] . N at Rev Canc er， 2012， 12(4)：252 ) ( [ 2] KEIR M E ， LIAN G SC， INDIRA G， e t al. Tis s ue ex p ression of P D - L1 mediates p eripheral T cell tolerance [J] . J Exp Med ， 2006，203(4)：883 ) ( [ 3] FRANCISCO LM，SALINA S VH，BROWN KE，et al. PD-L1regulates the deve l opment， mainten a nce， and functi o n of i n duced regulatory T cell s [ J ] . Clin Immunol ， 2009 ， 131(13) ： S41 ) ( [ 4] OKAZAKI T， HONJO T. PD-1 and PD-1 ligan d s： from discovery toc l inical appli c atio n [J ] . I nt Immunol， 200 7 ，19(7)：813 ) ( [ 5 ] IWAI Y ，ISHIDA M ， TANAKA Y，et a l. In v olvement of P D-L 1 o n t umor ce l ls i n t he escape f rom host i mmune sy s tem and tumor immunotherapy by P D-L1 blockade [J ]. P roc N a tl A ca d Sci U SA， 2002，99( 1 9)：12293 ) ( [ 6] BLAN K C ， MACKENSEN A. C ontribution of the PD-L1/PD-1 pathway t o T-cell exhaustion： an update on implications for chronic i nfections and tumor e vasion [ J ] . Cancer Immunol I m munother，2007，56(5)：739 ) ( [ 77 GAO Q， WAN G XY， QI U SJ ， et a l . Overexpression of PD-L 1 significantly associates with tumor aggressiveness a n d postoperative recurrence in human h epatocellular carcinoma [ J] . C lin CancerRes，2009，15(3)：971 ) ( [8 MU CY， H UAN G JA， CHEN Y， et al. High expression of PD- L 1 i n l ung c ancer m ay c ontribute t o poor prognosis and tumor c ells i mmune escape through suppressing tumor infiltrating dendritic ce l ls maturation [ J ]. Med Oncol， 2011，28(3)：682 ) ( [ 9] BLANK C， K U BALL J ， VO E LKL S， et al. B l ockade of P D-L1(B7-H1) augment s human tum o r-specific T ce l l res p onses in vitro [J] . Int J Cancer，2010，119( 2 )：317 ) ( [ 10] T TOPALIAN SL， DRAKE CG， PARDOLL DM. Tar g eting the PD-1/ ) ( B7-H1(PD - L1) pa t hway to activate an t i-tumor im m unity [J]. Curr Opin Immunol ， 2012，24 (2 ) ： 207 ) ( [ 11] C HEN L， HAN X. Anti-PD-1/PD-L1 th e rapy of h uman cancer： past， present， and future[J ]. J C lin Invest，2015， 125(9)： 3 384 ) ( 12 ] S WAIKA A， H A M MO ND WA， JOSEPH RW. Curr e nt stat e of a n ti- PD-L1 and anti-PD-1 a g ents in cancer therapy [ J ] . Mol Immunol， 2015，67(2)：4 ) ( 13 ] TENG F ， MENG X，KONG L，et al. P rogress and challenges of predictive biomarkers o f anti PD-1/PD-L1 im m unotherapy： a systematic revie w[ J ] . Cancer Lett， 2018，414：166 ) ( 14 ] H ERBST RS，SORIA JC，KOWANETZ M， e t al. Predictivecorre l ates of response to the anti-PD-L1 a ntibody MPDL3280A incancer patients [J ] . Nature，2014，515(7528)： 563 ) ( 1 5| P OWLES T，EDER JP ， FINE GD ， et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) t re a tment le a ds to clinical ac ti v i ty in me t astatic b ladde r cance r [ J ] . Natur e ，2014，515(7528)：558 ) ( [16 K OTSAKIS A ， GEORGOULI A S V. Avelumab，an a n ti-PD-L1 monoclonal a n tibody， shows activity in various tumour types[J].Lancet Oncol， 2017，18(5)：556 ) ( 17] RAMOS-ESQUIVEL A ， van d er LA A T A ， ROJAS-VIGOTT R， ) ( et al. Anti-PD-1/anti-PD-L1im m unotherapy versus docetaxel fo r previously treated advanced non-small cell lung cancer： a systematic r eview a nd meta-analysis of r a ndomised clin i cal tr i als [ J ] . E S MO Open，2017，2(3)： e000236 ) ( 18 VALECHA GK，VENNEPUREDDY A， I BRAHIM U， e t al.Anti-PD-1/PD-L1 antibodies in non-small cel l lung cancer： the era of immunotherapy[J ]. E xpert Rev A nticancer Ther， 2017， 1 7(1 ) ： 47 ) ( 191 A DCOCK JL， BARROW CJ， BA R NETT NW， et al. Chemiluminescence and e lectrochemiluminescence det e ction of controlled dru g s [J]. Drug Test Anal，2011，3( 3 )： 1 4 5 ) ( 20 WA N G L， YU C， YANG Y， et al. Dev e lopment of a rob u st reporter g ene assay t o m ea s ure th e b ioactivity of anti-PD-1/anti-PD-L1 the r apeutic antibodie s [J ]. J Pharm Biomed A n a l， 2017， 145 ： 447 ) ( [21 ] ]A NDERSON C L ， WAN G Y， RUSTANDI RR. App l ications of imaged c apillary isoelectric focussin g t echnique i n development of biopharmaceutical g lycoprote i n-based products [J ] . Electrophoresis，2012，33 ( 1 1 )：1538 ) ( (本文于2018年11月20日收到) ) ChineseJournal ofPharmaceutical Analysiswww.ywfocez.cn(C)China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net PD-1/PD-L1分子是目前免疫检查点领域倍受关注的靶点。截止 2017年底，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准了3个PD-L1抗体，分别为罗氏的Atezolizumab、阿斯利康的Durvalumab和辉瑞/默沙东的Avelumab，适应症包括非小细胞肺癌、 尿路上皮癌以及merkel细胞癌等少见癌种；国内也有10多家药企布局了该靶点抗体的研发。使用流式颗粒成像分析法的FlowCam 8100可以帮助用户对配方中的不溶性微粒进行检测。FlowCam具备高灵敏度，高质量的颗粒图像，精确的浓度检测和直测粒径等性能，从一次实验结果中就能够获得“颗粒有多少”，“颗粒有多大”，“颗粒是什么”等信息。目的：研究建立抗程序性死亡受体配体 1（programmed cell death protein ligand 1，PD-L1）单抗的质量控制方法。方法：利用成像毛细管等电聚焦电泳（imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis，iCIEF）、肽图对抗 PD-L1 单抗进行鉴别；利用还原 / 非还原十二烷基磺酸钠毛细管电泳 （capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate，CE-SDS）、分子排阻高效液相色谱（size exclusion-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）、离子交换高效液相色谱（ion exchange-high performance liquid chromatography，IEC-HPLC）对抗 PD-L1 单抗的纯度进行控制；利用细胞结合抑制法和转基因细胞法测定抗 PD-L1 单抗的活性；利用光阻法和液流成像分析法对不溶性微粒进行检测和分析。结果：抗 PD-L1 单抗的 iCIEF 检测结果具有特征性主峰，肽图检测具有相应特征峰，起到很好的鉴别作用。还原 CE-SDS 的轻链与重链峰面积之和的百分比为（98.37±0.21）%，非还原 CE-SDS 主峰峰面积百分比为（96.33±0.15）%；SEC-HPLC 单体的峰面积百分比为（99.43±0.02）%；IEC-HPLC 酸性区峰面积百分比、主峰峰面积百分比、碱性区峰面积百分比分别为（13.63±0.40）%、（80.00±0.36）%、（6.37±0.15）%。细胞结合抑制法与转基因细胞法的活性检测均呈现剂量反应曲线，反映抗 PD-L1 单抗剂量依赖性地阻断程序性死亡受体 1（programmed cell death protein 1，PD-1）与 PD-L1 的结合及后续的生物学效应。光阻法检测≥ 10 μm 及≥ 25 μm 的不溶性微粒数分别为（1.33±0.58）粒·mL -1 和（0.00±0.00）粒·mL -1 ；液流成像分析法检测 2~10 μm、≥ 10 μm及≥ 25 μm 的微粒数分别为（1 243.67±242）粒·mL -1 、（45.67±16.07）粒·mL -1 和（10.00±5.00）粒·mL -1 ，其中，蛋白聚体占 87.45%，非蛋白聚体占 12.55%。图 1 抗 PD-L1 单抗参比品（A）与样品（B）的 iCIEF 代表图谱图 2  抗 PD-L1 单抗参比品（A）与样品（B）的肽图代表图谱讨论：研究建立了抗 PD-L1 单抗的多种质控方法，为国内抗 PD-L1 单抗的质量检测提供了参考依据。郭莎，王开芹等，抗 PD-L1 单抗的质量控制研究，药物分析杂志，2019，39（1）：13-22Fluid Imaging Technologies(FlowCam)公司成立于1999年美国缅因州斯卡伯勒市，其研发并生产的FlowCam系列仪器是将流式细胞法组合到数字成像显微镜中，基于图像分析法的流式动态成像颗粒分析仪，它使颗粒分析变得更快，更简单。具有革新意义的FlowCam系列仪器被广泛应用于研发和质量控制，应用涉及全球多个领域。流式颗粒成像分析系统FlowCam®8000系列具有以下优点。1.测量粒度和颗粒形状-对每个颗粒成像后都可以获得30多种形态学测量结果。2.快速提供具有统计意义的结果-用户可在过程种观察到每分钟数以万计的颗粒。3.提供卓越的成像质量和基于成像法的测量参数-可以看到快速和准确的，可由定量数据证明的检测测量结果。4.自动化的，可建模的，具有统计学意义的 - 基于自动识别统计软件 - 可将不同的颗粒进行分门别类，从而节省时间。