多肽药物，特立帕肽中定量分析检测方案(液质联用仪)

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thermoscientific热线 800 8105118电话4006505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 C 2020 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 基于Obitrap超高分质质谱平台的多肽药物特立帕肽的定量分析 邵宇皓，黄敏赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词： Obitrap， 多肽药物，特立帕肽，定量分析 前言 多肽药物是介于大分子蛋白/抗体类药物和小分子药物之间的一类重要的药物分子，因其生物活性高、靶向专一性高、选择性高、毒副作用低等优点而被广泛应用于疾病治疗领域。Ther-mo Obitrap因其超高的分辨率，质量轴稳定性，已经广泛应用在了多肽药物结构表征中。Obitrap 作为高分辩还具有极高灵敏度和线性范围，因此也被越来越多的应用到药物的定量研究中[2.3] PTH 是状状旁腺主细胞分泌的由84个氨基酸组成的多肽类激素，其对于维持钙磷代谢的稳定起着至关重要的作用。特立帕肽(SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDV-HNF， 4117.7 Da)是一种人工重组合成的人PTH 1-34多肽，是第一个被美国食品药品监督管理局(Food and DrugAdministration，FDA)批准的抗骨质疏松性骨折的骨合成药物3. Thermo Scientific Q Exactive Focus 四极杆 Orbitrap 组合型质谱仪专为常规分析应用而设计，最高分辨率为7万，最大分辨率12Hz，可以在同一系统中同时实现准确可靠的定性和定量分析。 Obitrap Fusion Lumos是赛默飞世尔科技在2015年推出的三合一的静电场轨道阱超高分辨质谱仪。Lumos搭载的分段式四级杆技术(Advanced Quadrupole Technology，AQT)使离子传输效率至少提高了2倍，超高场的Obitrap拥有50万分辨率和20Hz的超快扫描速度，使Lumos在具有极佳的灵敏度同时，还拥有稳定性和动态范围。 本实验将基于两款Obitrap高分辩质谱Q Exactive Focus和Obit-rap Fusion Lumos建立多肽药物特立帕肽的定量分析方法，考察高分辩质谱Obitrap的定量能力。 样品配置： 称取特立帕肽粉末，加水稀释成5mg/mL的标准品储备液。用含5%乙腈， 0.1ug/pL BSA， 1%甲酸的稀释剂，逐级稀释特立帕肽标准品，配置成标准曲线。 色谱条件： 液相系统为： Thermo Vanquish Flex， 色谱柱为Thermo Accu-coreTM 150 C18 (50x2.1mm， 2.6um， 货号16126-052130)；柱温：45℃；流动相及梯度系统程序见表1 Time(min) A% B% 流速 (含0.1%FA的水) (含0.1%乙腈) (mL/min) 0 85 15 0.3 0.5 85 15 0.3 3.3 2 98 0.3 4.8 2 98 0.3 5 85 15 0.3 7 5 15 0.3 表1流动相参数 质谱条件： Q Exactive Focus， Obitrap Fusion Lumos的质谱参数见表2.扫描模式： SIM。特立帕肽的监测监子对、RF-lens 电压以及碰撞能等参数见表3。 Target m/z Charge Resolution RF Lens Focus 687.19 6 70K 50 Lumos 1030.2935 4 120K 60 表3tSIM参数 血浆样品前处理： 取150pL的人空白血浆，加入15pL的特立帕肽工作液，震荡混匀。按体积比1：6加入含75%乙腈，0.1%FA的沉淀剂后，充分震荡。6500g离心5min，取上清后，40℃挥干。挥干样品用150pL含10% ACN， 90%水，1%FA的复溶剂复溶，充分震荡，14000g离心5min， 取上清，上样5pL进行分析。 数据分析： 所有数据分析均使用Thermo ScientificTM TraceFinderTM 软件完成。TraceFinder平台包含了仪器控制，方法开发，数据定性定量批处理等功能。提峰时质量偏差为±5ppm。 实验结果 1、特立帕肽标准品在Focus， Lumos上的线性与准确度。 用稀释剂(含0.1ug/uL BSA， 1% FA， 5% ACN)的稀释剂逐级稀释特立帕肽标准品，配置成一系列浓度标准品，上样分析。结果表明， Focus对特立帕肽的定量下限为50 pg/mL(图1)，上样5pL，上柱约60 amol，示准曲线线性良好， R2=0.997，标准曲线各点回算的浓度在理论值的15%以内(表4)。 图1特立帕肽在Focus上的线性 Standard Theoretical Amt Calculated Amt Diff(%) (pg/mL) (pg/mL) 1 50 47.737 -4.53 2 100 87.251 -12.75 3 200 200.467 0.23 4 500 457.877 -8.42 5 1000 1051.464 5.15 6 2000 1981.783 -0.91 7 5000 5037.399 0.75 8 10000 11118.54 11.19 9 20000 20089.28 0.45 10 50000 55847.795 11.7 11 100000 101378.995 1.38 12 200000 191551.413 -4.22 表4 Focus标曲回算精密度 特立帕肽标准品在Lumos上的标准曲线见图2。Lumos对特立帕肽标准品的定量下限为20 pg/mL， 上样5 pL， 所以上柱量约为24amol。标准曲线各点回算与标示值的差异在15%以内(表5)，满足分析要求。 图2特立帕肽在Lumos上的线性 Standard Theoretical Amt Calculated Amt Diff(%) (pg/mL) (pg/mL) 1 20 22.418 12.09 1 50 52.537 5.07 2 100 98.675 -1.33 3 200 182.994 -8.5 4 500 461.694 -7.66 5 1000 1087.788 8.78 6 2000 2143.664 7.18 7 5000 4822.648 -3.55 特立帕肽的LOQ点在Focus和Lumos上的提峰图如图3，峰型良好，信噪比S/N>10， 重复5针的RSD<10%(表6)，表现出了良好的稳定性。 图3 Focus， Lumos上LOQ的峰图 表6LOQ(n=5)的平均峰面积和RSD% 2、特立帕肽血浆样品在Lumos上的线性与准确度。 同时在Lumos上考察了特例帕肽血浆样品的定量下限。取150uL的空白人血浆，加入一系列浓度梯度的特立帕肽标准品，配置成血浆标曲，用1：6体积的75% 乙腈沉淀后，离心去上清，挥干，复溶后进样。 结果显示， Lumos对于基质复杂的血浆样品仍表现出良好的线性，精密度，稳定性。特立帕肽最低定量下限为50 pg/mL，线性范围50 pg/mL-50 ng/mL (图4)，1000倍的线性范围，上柱量约60 amol，标曲各点Diff值<10%(表7)。 图4特立帕肽的血浆标曲 tDiff(%) (pg/mL) (pg/mL) 1 50 46.77 -6.46 2 200 207.189 3.59 3 500 447.749 -10.45 4 1000 976.311 -2.37 5 2000 1982.353 -0.88 6 5000 5487.477 9.75 7 10000 10855.325 8.55 8 20000 20256.582 1.28 9 50000 48490.245 -3.02 表7血浆标曲回算精密度 本文分别在Obitrap Focus， Lumos上建立了大分子多肽类药物特例帕肽的定量分析方法。结果表明，高分辩Obitrap对特立帕肽表现出良好的定量能力，定量下限可以分别达到上柱60amol， 24 amol。同时，对于基质更为复杂的血浆样品， Lumos上可以达到定量下限上柱60 amol，灵敏度满足临床上对特立帕肽的检测要求。Obitrap作为高分辨质谱，在拥有超高分辨率的同时，兼具出色的灵敏度和稳定性，可以应用大分子多肽类药物的定量分析与检测。 thermoscientific ( [1] Lau J L ， D unn M K. Therapeutic peptides： Hist o rical perspectives，current development trends， an d future directions[J]. B i oorganic & me-dicinal chemistry， 2018，26(10)：2700-2707. ) ( [2] Dillen L ， Cuyckens F . H igh-resolution M S： f i rst choice f or p eptidequantification?[J].Bioanalysis， 201 3 ， 5(10)： 1145-1148. ) ( [3] Kang L ， Weng N ， J i an W . LC-MS bioanalysis of i ntact pr o teins andpeptides[J]. Biomedical Chromatography， 2019： e4633. ) ( [4] Quattrocchi E， Kourlas H. Te r iparatide： a review[J]. Clinical th e rapeu- tics， 2004，26(6)：841-854. ) 本文分别在Obitrap Focus，Lumos上建立了大分子多肽类药物特例帕肽的定量分析方法。结果表明，高分辩Obitrap对特立帕肽表现出良好的定量能力，定量下限可以分别达到上柱60amol，24 amol。同时，对于基质更为复杂的血浆样品，Lumos上可以达到定量下限上柱60 amol，灵敏度满足临床上对特立帕肽的检测要求。Obitrap作为高分辨质谱，在拥有超高分辨率的同时，兼具出色的灵敏度和稳定性，可以应用大分子多肽类药物的定量分析与检测。