猪肉中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮检测方案(液相色谱仪)

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SSL-CA20-058Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-454 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 测定猪肉中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留 LCMSMS-454 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-40 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定猪肉中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的方法，该方法可在4 min 内完成对待测物的检测。醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮在1.0 ug/L~100.0 ug/L 浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，，可用于猪肉中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留的快速检测。 关键词：三重四极杆质谱猪肉醋酸甲地孕酮醋酸甲羟孕酮 食用动物饲养中促生长性激素的滥用已成为全球性的食品安全问题。醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮都是人工合成的甾体药物，能促进畜禽生长，提高饲料转化率，有利于蛋白质沉积。但该类激素在动物食品中的残留可能会危害消费者健康，甚至具有潜在的致畸性与致癌性。有研究表明儿童性早熟、妇女乳腺癌和子宫癌发病率上升也与食品中性激素残留有关。我国农业农村部早早2002年发布的第235号文件中就规定醋酸甲地孕酮不得在动物性食品中检出。 目前检测性激素的前处理方法主要有固相萃取法、 QuEchERs 法、液液萃取法等。固相萃取法由于方法可靠、操作简单、成本低，是目前最普遍采用的前处理方法。 本文参照国家标准检测方法 GB31660.4-2019《食品安全国家标准动物性食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮的测定液相色谱-串联质谱法》，试样经乙腈提取，正己烷除脂，混合阳离子柱净化，甲醇洗脱后使用岛津 LCMS-8050液质联用系统测定，内标法定量。此方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于猪肉中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留的快速检测。 实验部分 1.1仪器 本实验使用超高效液相色谱仪LC-40与三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用系统。具体配置为 LC-40D X3×2输液泵， DGU-405在线脱气机， SIL-40C X3自动进样器， CTO-40C 柱温箱，， SCL-40 系统控制器， LCMS-8050三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.97 色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GISS C18 (50mm×2.1 mml.D.， 1.9 um，SGLC， P/N： 227-30048-01) 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液；B相-0.1%甲酸乙腈溶液 流速：0.30mL/min 进样体积： 10 uL 洗脱方式：梯度洗脱，初始浓度为B相20%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 Time Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 20 1.50 Pumps Pump B Conc. 90 2.00 Pumps Pump B Conc. 90 2.50 Pumps Pump B Conc. 50 3.00 Pumps Pump B Conc. 20 4.00 Controller Stop 质谱条件 离子源：ESI，正离子模式 DL管温度：250℃ 离子源接口电压：3.5kV雾化气：氮气3.0 L/min干燥气：氮气10 L/min 加热气：空气10 L/min 加热模块温度：400℃接口温度：300℃扫描模式：多反应监测(MRM)MRM 参数：见表2 碰撞气：氩气 驻留时间： 47 ms 表2 MRM 参数 化合物名称 英文名称 化学式 CAS No. 监测离子对 Q1 pre (V) CE Q3 Pre (V) 醋酸甲地 C24H3204 595-33-5 385.40>267.30* -11.0 -19.0 -19.0 孕酮 Megestrol acetate 385.40>325.40 -11.0 -15.0 -23.0 Medroxyprogester -one acetate 醋酸甲羟 C24H3404 C24H29D304 71-58-0 387.40>327.40* -11.0 -13.0 -16.0 孕酮 387.40>285.40 -11.0 -19.0 -20.0 氘代醋酸甲地 孕酮 Megestrol acetate-D3 388.40>270.40* -11.0 -18.0 -13.0 注：*表示定量离子对 1.3样品前处理方法 取试样2g(准确到±20 mg) 于50mL离心管中，加内标工作液(1 ug/mL)40 uL， 加 0.2 mol/L 乙酸铵缓冲液4mL，涡旋混匀后加入β-盐酸葡萄糖醛醛酶/芳基硫酸酯酶40uL，于37℃下避光水浴低速振荡，酶解12h。试样经酶解酶，加乙酸乙酯10 mL，于旋涡振荡器上剧烈振荡10 min， 4000 r/min 离心5 min，取上清液至梨形瓶中。残渣加乙酸乙酯10 mL重复提取1次，合并上清液，50℃旋转蒸发至干。加乙腈10mL、正己烷5mL使溶解，转至50mL离心管中，低速涡旋10 s， 3000 r/min 离心 2 min，弃正己烷层，下层液于50℃旋转蒸发至干，加30%甲醇水溶液3mL，溶解，备用。混合阳离子固相萃取柱用甲醇、水各3mL活化，取备用液过柱，依次用水、50%甲醇溶液各3mL淋洗，抽干。用甲醇5mL洗脱，洗脱液液50℃下氮气吹干。用 0.2mL 初始流动相溶液溶解残余物，涡旋混匀，15000 rpm高速离心10 min， 取上清液上机测定。 1.4标准溶液的配制 精密量取适量混合标准工作液及内标标准工作液，用流动相稀释配制成浓度为1、2、5、25、50和100 ug/L的系列标准溶液((内标均为20 pg/L)。以待测物与内标的特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度比为横坐标，内标法绘制标准曲线。 结果与讨论 2.1标准样品的MRM 色谱图 图1 1ug/L醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮MRM色谱图(内标20 pg/L) 2.2线性范围与检出限 将浓度为2、5、25、50和100 ug/L的醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮标准工作液(内标浓度为20 ug/L)，按1.2中的分析条件进行测定。以浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，制作标准曲线，内标法定量，绘制校准曲线如图2所示。所得校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见表3。图3为0.2 ug/L 醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮的 MRM 色谱图。根据检出限MDL=3.3S/N， 定量限LOQ=10 S/N 计算检出限和定量限，结果见表3。 图2醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮校准曲线 图3 0.2ug/L醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮标样 MRM 色谱图 表3 标准曲线与检出限信息 化合物 校准曲线 R 线性范围 (ug/L) 准确度 定量限(ug/L) 检出限 (ug/L) 醋酸甲地孕酮 Y=0.0464X+0.0197 0.9997 2.0~100 87.3-104.4% 0.04 0.01 醋酸甲羟孕酮 Y=0.0278X+0.0241 0.9996 2.0~100 86.6-104.4% 0.04 0.01 2.3精密度实验 对浓度为 0.2 ug/L、2 ug/L 和25 ug/L的醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮标准工作液连续测定6次，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。结果显示：不同浓度样品中待测物保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.10%~0.18%和1.25%~5.19%之间，仪器精密度良好。 表4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 0.2ug/L 2ug/L 25 ug/L RSD% RSD% RSD% RSD% RSD% RSD% (R.T.) (Area) (R.T.) (Area) (R.T.) (Area) 醋酸甲地孕酮 0.18 5.19 0.13 2.50 0.10 1.85 醋酸甲羟孕酮 0.13 3.25 0.14 1.71 0.11 1.25 2.4回收率实验 称取空白猪肉样品，加入醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮标准溶液，使加标浓度分别为1 ug/kg， 5 ug/kg和20 ug/kg。按照1.3样品前处理方法提取净化后，测定醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮的加标回收率。空白猪肉样品和加标浓度为1 ug/kg 猪肉样品 MRM 色谱图如3所示，加标回收率结果见表5。由结果可知，该方法灵敏度高，，准确率好，可以满足猪肉中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留的快速检测。 图3 空白猪肉及加标浓度为 1 ug/kg 猪肉勺品 MRM 图谱 表 5 醋 酸 甲 地 孕 酮 和 醋 酸 甲 羟 孕 酮 的 加 标 回 收 率 结 果 ( n = 3 ) 平均回收率% 1ug/kg 5pg/kg 20 ug/kg 醋酸甲地孕酮 82.2 90.6 97.7 醋酸甲羟孕酮 81.7 85.8 89.2 结论 本文根据 GB 31660.4-2019《食品安全国家标准动物性食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮的测定》建立了使用岛津超高效液相色谱 LC-40和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定猪肉中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的方法。该方法使用 Shim-pack GISS C18 色谱柱，.，可在4 min 内完成对待测物的检测。醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮在1.0~100 ug/L浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，，可用于猪肉中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的快速分析。 岛津应用云 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-40和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用测定猪肉中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的方法，该方法可在4 min内完成对待测物的检测。醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮在1.0 μg/L~100.0 μg/L浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于猪肉中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留的快速检测。