动物源性食品中氢氯噻嗪等10种利尿剂检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA22-066Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-626 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 法测定动物源性食品中氢氯噻嗪等10种利尿剂的残留量 LCMSMS-626 摘要：本文参考国家出入境检验检疫行业发布的行业标准《SN/T 5167-2019出口动物源食品中氢氯噻嗪等 10种利尿剂残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》，使用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050 建立快速分析方法。该方法采用基质匹配曲线外标法定量，线性关系良好，相关系数均大于0.9969；仪器检出限在0.06~0.32 ng/mL 之间，完全满足标准中对检测灵敏度的要求；不同浓度标液重复测试，其保留时间和峰面积的相对标准偏差RSD 值分别在 0.05%~0.17%和0.43%~4.12%之间，仪器精密度良好；平均加标回收率在64.82%~83.78%之间，回收率良好。该方法灵敏可靠，可为相关行业人员参考使用。 关键词：三重四极杆质谱联用仪动物源食品 利尿剂 氢氯噻嗪 噻嗪类利尿剂是一类促进体液从组织中排出的西药，主要有氯噻嗪、氢氯噻嗪、螺内酯、丙磺舒和氯噻酮等10种化合物，，在临床上作为口服利尿药和降压药广泛使用。滥用此类利尿剂可影响肾脏代谢，小引起低血钾和缺钾、脂肪代谢紊乱、糖代谢改变、肌肉血流改变甚至肌肉坏死。在体育运动中，个别运动员会在参赛体质检查前服用利尿剂，通过快速排尿来快速减轻身体质量；或在兴奋剂检查前服用利尿剂，用以增加尿液和禁用药物代谢速度，使药物随尿液排出体外，从而逃避药物检测。因此，国家体育总局在《2021年兴奋剂目录》中将利尿剂及其他具有相似化学结构的物质归属为禁用物质。由于运动员在日常饮食中需摄入肉类以提供足够的能量，若摄入的肉类中存在利 尿剂残留，也可能会导致尿检阳性，从而导致误检误判。因此，检测运动员膳食动物源性食品中利尿剂的残留量至关重要。 检测方法主要为高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱联用法。由于利尿剂类药物经动物吸收、代谢后，在肉组织等食品中的残留量很低，因此，需要有更高灵敏度和便捷性的检测方法。国家出入境检验检疫行业发布行业标准《SN/T5167-2019出口动物源食品中氢氯噻嗪等10种利尿剂残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》。 本文参考 SN/T 5167-2019 该行业标准，使用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050 建立分析方法，供相关检测人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验采用岛津Nexera-XR与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统。具体配置为： 系统控制器： CBM-40A自动进样器： SIL-40C XR输液泵： LC-40DXR×2质谱仪： LCMS-8050柱温箱：CTO-40C色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99在线脱气机：DGU-405 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shim-pack GIST-HP C18-AQ (100mm×2.1mml.D.， 1.9um)P/N：227-30807-02，岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A相-水；B相-0.01%乙酸甲醇 流速：0.3mL/min 柱温：40℃ 进样量：5uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 Time Module Command Value 2.50 Pumps Pump B Conc. 60 3.50 Pumps Pump B Conc. 75 6.00 Pumps PumpB Conc. 85 6.05 Pumps Pump B Conc. 95 8.00 Pumps Pump B Conc. 95 8.05 Pumps Pump B Conc. 10 11.00 Controller Stop 质谱条件： 离子源： ESI(±)雾化气流速：3.0L/min加热气流速：10.0L/min DL温度：280℃ 加热模块温度：480℃ 接口温度：380℃ 干燥气流速：10.0 L/min 描模式：多反应监测(MRM) 表2 MRM 参数 化合物名称 CAS号 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 氨苯喋啶 254.10 237.10* -10 -16 -17 396-01-0 168.10 -13 -22 -18 丙磺舒 57-66-9 286.05 202.00* -14 -15 -14 121.10 -15 -26 -13 螺内酯 52-01-7 341.15 187.10* -13 -21 -20 107.10 -10 -30 -22 坎利酮 976-71-6 341.15 187.10* -10 -22 -13 107.10 -10 -30 -22 精磺胺 121-30-2 283.95 205.10* 13 20 21 169.10 19 22 16 氯噻嗪 58-94-6 293.95 214.00* 20 18 24 179.10 14 43 17 氢氯噻嗪 58-93-5 295.95 268.90* 14 18 29 205.10 14 22 21 乙酰唑胺 59-66-5 221.05 83.10* 15 17 30 58.00 15 14 21 氯噻酮 77-36-1 337.00 146.00* 12 18 28 190.00 12 16 19 呋塞米 54-31-9 329.00 285.00* 11 13 13 205.10 11 21 12 *表示定量离子 样品前处理及标准工作溶液的配制 2.1样品前处理 2.1.1样品提取 称取约2g试样(精确至0.01g) 置于50mL离心管中，加入10mL乙腈和2g磷酸二氢钾，振荡提取30min， 于0℃以9000 r/min 转速离心5min， 取上清液，再加入10 mL乙复重复提取1次，离心后合并上清液于50mL离心管中，待净化。 2.1.2净化 在待净化上清液中加入150 mg 无水硫酸镁、50 mg PSA、50 mg C18、7.5 mg GCB， 涡旋混合30s， 于0℃以9000 r/min 离心 5 min，取全部上清液，于45℃下氮吹至近干，准确加入2.0mL 30%甲醇水溶液(含0.01%乙酸)溶解，过 0.22 um微孔滤膜，待测定。 2.2标准溶液的配制 标准储备溶液的配制：精密称取以上10种利尿剂固体标准品，甲醇溶解，获得1.0 mg/mL各储备溶液。 基质匹配校准工作溶液的配制：首先分别将各标准储备溶液混合，制得100mg/L利尿剂混合溶液，再使用30%甲醇溶液(含0.01%乙酸)将该混合溶液稀释，制得浓度分别为20、40、100、200、400、1000、2000和4000 ng/mL纯标溶液，以待使用。取某空白样品，按照2.1法处理样品，制得空白基质溶液。分别取以上各纯标溶液，使用该空白基质溶液对应稀释，分别获得浓度分别为1、2、5、10、20、50、100和200 ng/mL 基质匹配的利尿剂标准工作溶液。 结果与讨论 3.1基质匹配校准溶液色谱图 乙酰唑胺2.0e5- 1.0e5· 精磺胺 2.0e5- ·1.0e5· 1.5e5-氯噻嗪 1.0e5·- 5.0e4- 1. ： 0.0e0 2.75 3.00 T 2.5 氢氯噻嗪 2.65e5 Ｑ337.00>146.00 (-) 1.0e5 氨苯喋啶 7.5e4- 5.0e4- 2.5e4- .0.0e0 3.0 8.52e4 氯噻酮 图1 基质匹配校准溶液色谱图(5ng/mL) 3.2校准曲线 将上述浓度分别为1、2、5、10、20、50、100和200 ng/mL基质匹配标准工作溶液，按1.2分析条件进行测定，外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，如图2所示；所得校准曲线线性关系良好，相关系数均大于 0.9969， 线性回读精确度在90.4~108.0%之间，仪器检出限 (ASTM 法) 在 0.06~0.32 ng/mL之间，满足 SN/T5167-2019中规定的灵敏度要求。 Area 图2 利尿剂基质匹配校准曲线 表3 10种利尿剂线性关系 (权重1/c) 序号 化合物名称 校准曲线 线性范围 (ng/mL) 相关系数 r 准确度 % 检出限 (ng/mL) 1 氨苯喋啶 Y=(191261)X+(1452.58) 1~100 0.9969 90.4~105.3 0.32 2 丙磺舒 Y=(125641)X+(2940.99) 1~200 0.9982 91.3~105.8 0.06 3 螺内酯 Y=(42303.0)X+(-710.726) 1~100 0.9991 94.7~104.3 0.30 4 坎利酮 Y=(62991.0)X+(2817.92) 1~100 0.9998 97.7~103.7 0.31 5 精磺胺 Y=(8122.26)X+(-530.319) 1~200 0.9989 95.4~106.7 0.21 6 氯噻嗪 Y=(79289.9)X+(20207.3) 1~100 0.9969 92.6~108.0 0.10 7 氢氯噻嗪 Y=(85630.8)X+(3815.21) 1~200 0.9991 94.7~105.7 0.06 8 乙酰唑胺 Y=(45417.9)X+(1177.57) 1~200 0.9997 96.1~102.8 0.14 9 氯噻酮 Y=(34735.1)X+(1014.35) 1~200 0.9987 93.7~106.5 0.10 10 呋塞米 Y=(150210)X+(9724.80) 1~200 0.9992 94.1~105.4 0.10 3.3精密度 对不同浓度标准工作液连续测定6次，考察仪器精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。结果显示不同浓度下，各化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.05%~0.17%和0.43%~4.12%之间，仪器精密度良好。 表4 保留时间和峰面积重复性结果 (n=6) RSD% RSD% 序号 化合物名称 (2ng/mL) (5ng/mL) R.T. Area R.T. Area 1 氨苯喋啶 0.07 2.93 0.10 1.97 2 丙磺舒 0.11 2.35 0.07 1.81 3 螺内酯 0.10 4.12 0.07 2.86 4 坎利酮 0.09 3.23 0.07 0.43 5 精磺胺 0.14 3.36 0.17 2.93 6 氯噻嗪 0.07 3.33 0.16 3.07 ( 氢氯噻嗪 0.08 1.36 0.16 1.11 8 乙酰唑胺 0.07 2.41 0.15 1.62 9 氯噻酮 0.05 3.12 0.13 4.01 10 呋塞米 0.09 1.61 0.09 0.81 3.4回收率 根据行业标准SN/T5167-2019中所明确的样品类型，本实验选择其中一样品类型牛奶进行回收率实验。分别各取6份均为2.00g的全脂牛奶样品，分为两组，每组中分别加入10 uL和20uL的1.0mg/L利尿剂混标溶液，使溶液的理论定容浓度分别为 5 ng/mL 和 10 ng/mL，按照2.1处理方法处理样品，后上机测定。扣除牛奶本底值后再计算各化合物的平均回收率，牛奶空白和牛奶前加标色谱图分别如下图3-4。计算结果显示，10种利尿剂化合物的平均回收率在64.82%~83.78%之间，回收率良好，具体结果见表5。 图3牛奶空白基质色谱图 图4牛奶空白基质前加标色谱图 (5.0 ng/mL) 表5回收率测试结果(n=3) 序号 化合物名称 平均加标回收率 加标浓度 (5ng/mL) 加标浓度(10ng/mL) 1 氨苯喋啶 80.98 83.78 2 丙磺舒 70.76 72.52 3 螺内酯 70.28 73.46 4 坎利酮 64.82 67.73 5 精磺胺 66.12 71.56 6 氯噻嗪 67.46 70.98 7 氢氯噻嗪 77.06 79.01 8 乙酰唑胺 67.36 71.38 9 氯噻酮 77.02 78.75 10 呋塞米 68.26 69.86 结论 本文参考检验检疫行业标准 SN/T 5167-2019， 建立使用岛津LCMS-8050 在11 min 内快速测定动物源食品中10种利尿剂残留的分析方法。该方法线性范围宽、重复性好、准确度高，各化合物的仪器检出限 (ASTM法)在0.06~0.32 ng/mL之间，完全满足标准中关于利尿剂的检测要求，可以作为动物源食品中10种利尿剂残留量的监测方法。 岛津应用云 本文参考检验检疫行业标准SN/T 5167-2019，建立使用岛津LCMS-8050在11 min内快速测定动物源食品中10种利尿剂残留的分析方法。该方法线性范围宽、重复性好、准确度高，各化合物的仪器检出限（ASTM法）在0.06~0.32 ng/mL之间，完全满足标准中关于利尿剂的检测要求，可以作为动物源食品中10种利尿剂残留量的监测方法。