脂质中脂肪酸侧链的C=C双键检测方案(液质联用仪)

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「技术简报WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「技术简报 UPLC/QTof MS结合在线PB光化学反应 快速检测复杂体系中脂质成分准确鉴定脂肪酸侧链的C=C双键位置 袁铭1，赵婧2，徐永威1，陈茜3， Kate Yu1，瑕瑜2，欧阳证2 1沃特世科技(上海)有限公司，?清华大学，3北京清谱科技有限公司 技术优势 Waters UPLC/QTof质谱系统在线连接PURSPEC Analyzer光化学反应器实现快速高效复杂样品中脂质成分的精准分析 3针进样快速解析复杂样品中脂质种类获得脂类化合物中脂肪酰基/烷基链信息，以及鉴定脂类化合物不饱和脂肪酸侧链上C=C双键的数量及位置 Waters MassLynx数据采集软件与PURSPECC=C双键分析软件通过WatersSymphony 软件平台连接使得数据采集处理分析自动进行并快速得出结果 简介 本文介绍了基于Waters UPLC/QTof 质谱系统利用PURSPEC Q Analyzer 光化学反应器快速分析复杂生物样品中脂质成分包括准确鉴定C=C双键位置的工作流程与实验结果。 解决方案 沃特世超高效液相色谱(UPLC)+ PURSPEC光化学反应器(Analyzer)+沃特世四极杆飞行时间串联质谱(QTof MS)系统(图2)。 UPLC HILIC快速分离脂质类别，Q Analyzer进行PB光化学反应， QTof质谱仪进行检测。样品3次进样即可快速解析其中脂质的种类，脂肪酰基/烷基链信息，以及不饱和脂肪酸链中C=C的数量与位置。 背景 脂类化合物作为细胞膜的组成部分在体内细胞内环境调节中起着重要的作用。科学家们越来越强烈地认识到脂质代谢及信号通路的破坏都与代谢相关疾病的发生和发展有直接关联。以此催生脂质组学，用来全面识别和鉴定不同种类的脂质样本，并定量监测他们在不同生理或病理条件下的上调与下调。 近年来，日新月异的质谱(MS)技术早已成为脂质组学研究的关键平台。采用质谱技术进行脂质组学的研究已使不少相关的技术关键点成为脂质分析的常态，比如：脂质的种类、脂肪酰基/烷基组成，甚至脂肪酰基/烷基链的sn位置信息。但是，脂质组学研究里仍有一些技术难点尚需攻破。比如：如何定位与定量脂质化合物不饱和脂肪酸链上的碳碳双键(C=C)。 据文献报道，对于一些含不饱和脂肪酸的脂类化合物，即便便们分子量相同，其生理作用也会因C=C位置不同而有差异[1.2]。近年来，清华大学的瑕瑜团队率先报道了使用Paterno-Buchi(PB)光化学反应，借助液质联用平台，能够快速对复杂脂类混合物中的不饱和脂质进行定性同时对C=C位置进行鉴定[3-5]。如图1的流程图所示，丙酮做为PB反应试剂被加入流动相中。当流动相带着样品流经PB光化学反应器(学 Analyzer)时，在紫外光254 nm波长照射下，脂质样品中的不饱和脂肪酸在每一个C=C位置皆与丙酮发生反应，其产物为一对M+58 Da的化合物(图1)。这对产物在质谱MSMS条件下即可碎裂产生质量差为26Da的诊断离子对，可以用来判断双键位置。每一对△26的离子代表一个C=C，依其质量数可判断双键所在位置。 图2.LC-PB-MS系统鉴定脂质C=C位置流程图5]。 方案结果展示 QAnalyzer在线串联于UPLC和QTof之间，100 ug/mL浓度的牛耳提取物，如图3总离子流图所示，样品经BEH HILIC色谱柱(100x2.1 mm， 1.7 um) 按lipid class进行分离。 图3.牛肝提取物总离子流图显示样品经HILIC色谱柱依脂质类别而分离。图中所标：PE为脑磷脂；PC为卵磷脂；SM为鞘磷脂。 我们以磷脂类成分为例诠释该工作流程如何3针进样完成复杂脂类样品中脂质的鉴定：第一针：采集ESI+MS数据，获得脂质分子离子信息，且通过特征碎片、中性丢失辅助元素组成得到脂质的类别信息；第二针：根据第一针的信息采集ESIMS/MS数据，判断磷脂连接的脂肪酰基链组成；第三针，开启Q Analyzer，样品在线与流动相中的丙酮进行PB反应，根据第一针的信息采集[M+58]+的ESI+MS/MS数据。每个C=C会对应一个质量差为26Da的诊断离子对，从而确认及判断双键的数量与位置。如图4所示。 图4.3针进样鉴定脑磷脂PE 16：0_18：1(△9)示例(a)正离子模式全扫描，得到脂质类别信息；(b)负离子模式下MS/MS碎片得到脂肪酰基链的组成；(c)开启 Analyzer， 正离子MS/MS下得到相差26Da的诊断离子，判断双键位置。 此方法对于磷脂异构体及多双键位置的判断同样有效。如图5中PE18：0_20：4(A5，8，11，14)和PE16：0_22：4(△7，10，13，16)各含有4个C=C位置异构体的鉴定，通过4对诊断离子439/465，479/505，519/545，559/585可快速判断双键的位置。 图5. PE 18：0_20：4 (△5，8，11，14)和PE 16：0_22：4(△7，10，13，16)多双键位置异构鉴定示例。 结论 Waters UPLC-QTof质谱系统与PURSPEC Q Analyzer光化学反应器串联结合，形成脂质组学定性及双键定位系统，3针进样可高效快速地对复杂脂类体系中的不同脂质成分进行精准分析，包括C=C位置的定位，实现对C=C位置异构体的相对定量，大大提升科研工作者的工作效率。 ( 参考文献 ) ( [1] Corda D， De Matteis MA. Lipid Signalling in H ealth and Disease. FEBS J. 2013，280(24)：6280. ) ( [2] Masoodi M， Kuda O， Rossmeisl M， Flachs P， K o pecky J. Lipid Signaling i n Adipose T issue： ConnectingInflammation & Metabolism. Biochim Biophys Acta. 2015，1851(4)，503-18. ) ( [3] Ma X， Xia Y . Pinpointing Double Bonds in Lipids by Paterno-Buchi Reactions and Mass Spectrometry，Angew Chem Int Ed Engl. 2014， 53 (10)，2592-6. ) ( [4] Ma X， C hong L， Tian R， Shi R， Hu TY， Ouyang Z， Xia Y . Identification and quantitation o f lipid C=Clocation isomers： A shotgun l i pidomics approach enabled by photochemical reaction. Proc Natl AcadSci USA. 2016， 113(10)：2573-8. ) ( [5] Zhang W， Zhang D， Chen Q， Wu j， Ouyang Z， Xia Y. Online photochemical derivatization enablescomprehensive mass spectrometric analysis of unsaturated phospholipid isomers. Nat Commun. 2019， 10(1)：79. ) 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特世科技(上海)有限公司 上海办公室：021-61562666 北京办公室：010-57690500 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 广州办公室：020-28296555 Waters China Limited 香港办公室：852-29641800 ( Waters和The Science o f What’s Possibl e 是沃特世公 司的 注 册 商标。 所有其他的商标属于各自的所有者。 ) 免费售后服务热线：800(400) 820 2676WWw.waters.com UPLC/QTof MS结合在线PB光化学反应快速检测复杂体系中脂质成分准确鉴定脂肪酸侧链的C=C双键位置 UPLC/QTof MS结合在线PB光化学反应快速检测复杂体系中脂质成分准确鉴定脂肪酸侧链的C=C双键位置 简介本文介绍了基于Waters UPLC/QTof 质谱系统利用PURSPEC Ω Analyzer 光化学反应器快速分析复杂生物样品中脂质成分包括准确鉴定C=C双键位置的工作流程与实验结果。技术优势■ Waters UPLC/QTof质谱系统在线连接PURSPEC Ω Analyzer光化学反应器实现快速高效复杂样品中脂质成分的有效分析■ 3针进样快速解析复杂样品中脂质种类，获得脂类化合物中脂肪酰基/烷基链信息，以及鉴定脂类化合物不饱和脂肪酸侧链上C=C双键的数量及位置■ Waters MassLynx数据采集软件与PURSPEC C=C双键分析软件通过Waters Symphony 软件平台连接使得数据采集处理分析自动进行并快速得出结果结论Waters UPLC-QTof质谱系统与PURSPEC Ω Analyzer光化学反应器串联结合，形成脂质组学定性及双键定位系统，3针进样可高效快速地对复杂脂类体系中的不同脂质成分进行有效分析，包括C=C位置的定位，实现对C=C位置异构体的相对定量，大大提升科研工作者的工作效率。