血浆中乙酰胆碱检测方案(液质联用仪)

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高效液相色谱-串联质谱法对血浆中乙酰胆碱的测定 潘峰， 孙玮， 马莉， 张青 (第三军医大学科研部生物医学分析测试中心重庆，400038) 摘要：建立血浆中乙酰胆碱的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定方法。采用 ZORBAX SB-Aq 柱为色谱柱；乙腈-0.08%甲酸水溶液为流动相(5：95)；流速0.5ml/min；柱温：30℃；质谱条件为电喷雾离子源(ESI)， 检测方式为正离子多离子反应监测(MRM)，以 m/z146/87、146/60为定性离子对， m/z 146/87为定量离子；乙酰胆碱的线性范围为0.5~100.0 ng/mL， 其精密度小于5%，回收率在80-110%之间，结果表明该法准确、灵敏、特异，适用于血浆中乙酰胆碱的测定。 关键词：高效液相色谱-串联质谱；乙酰胆碱；去甲肾上腺素；血浆 神经递质是一种在神经系统中担当信使的特定的化学物质，在生命活动中起着非常重要的调控作用"。乙酰胆碱是一种胆碱类的神经递质，对反应的警戒性，大脑的记忆力，以及学习能力都会产生影响。对乙酰胆碱的测定多采用电化学检测法，但其步骤十分繁杂。因此，在实际复杂的样品以及医学临床诊断中需要发展一种高专属性、简单、快速、灵敏的检测方法。 自从色谱-质谱联用技术发展以来，人们利用该技术在化学物质定性定量分析、临床医药检测、以及生物大分子如蛋白质、核酸、糖类等方面进行了广泛和深入的研究。本文介绍了利用液质联用技术建立了乙酰胆碱一种新的检测技术方法，并为医学研究及临床诊断提供准确、快速、灵敏的分析方法。 1实验部分 1.1药品与试剂 乙酰胆碱标准品，甲酸纯品均购自 Sigma公司；乙氰(色谱纯， 美国 Fisher公司)；水为超纯水。 1.2仪器 Agilent 6410 Triple Quad LC/MS (Agilent)；旋涡混合器(原上海医科大学仪器厂)；电子天平(北京赛多里斯有限公司)；高速离心机 (Sigma 公司)。 1.3色谱及质谱条件 色谱条件： ZORBAX SB-Aq 柱(4.6 mm×150 mm， 5 Hm))为色谱柱，流动相为乙腈-0.08%甲酸(5：95)，流速 0.5 mL/min， 柱温30℃。质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)， 正离子模式，干燥气流桑 12L/min， 干燥气温度280℃， 雾化气压力 45psi， 细管管电压4000V，扫描模式采用多离子反应监测(MRM)。 1.4血样预处理 取血浆样品0.2 mL， 加入0.8mL乙腈漩涡混匀，放置1h， 然后10 000 r/min 离心15min， 移取上清液， ( 作者简介：潘峰(1964-)，男， 重 庆，高级 实 验师， Tel： 02 3 -68752349， E-mail： panfeng200609@163.com ) 进样 20uL， 进行LC- MS测定。 2结果与讨论 2.1色谱条件分析 选择 ZORBAX SB-Aq 水相柱为分离柱，大大提高了乙酰胆碱的保留时间。0.08%甲酸为A相，B相为而乙腈，其比例在5%时，乙酰胆碱在合理的保留时间内出峰，可避免其样品中其它基质的干扰，如图1所示，乙酰胆碱的保留时间为5.69min。 2.2质谱分析 扫描模式采用多反应监测(MRM)测离子对。如图2A所示，146→87、146→60.1为乙酰胆碱所对应的碎片峰。分别选择两个离子对来对乙酰胆碱监测。乙酰胆碱为m/z 146→87，裂解电压 88V， 裂解能量5V，另外一个离子对为 m/z 146→60.1，裂解电压88V， 裂解能量10V。如图2B所示， 乙酰胆碱裂解为87离子对峰比裂解为60.1峰高。因此，选择峰面积大的m/z 146→87作为定量离子对。 图1乙酰胆碱的质谱谱图 图2乙酰胆碱的 MS/MS 图(A)和MRM图(B) 2.3标准曲线 依次配置不同浓度的乙酰胆碱标准系列溶液，配成质量浓度为0.5、.02、10.0、50.0、100.0 ng/mL，建立标准曲线。以测得的峰面积y对乙酰胆碱的浓度x(ng/mL)作直线回归，线性关系良好，标准曲线回归方程为： y=3921. 1620x -163.3823， R二=0.9999，线性范围：0.5~100.0 ng/mL。 2.4方法回收率与精密度 按1.6方法处理血浆样品，计算精密度及回收率。其回收率在80-100%之间，其精密度在5%以内，符合生物样品分析要求。 2.5血浆样品中的测定 从医院中获取采集正常人血浆标本，利用该方法对人血浆中的乙酰胆碱进行分析检测，其血浆中乙酰胆碱的含量在30.84±0.58 ng/mL. 3结论 本实验采用液质联用技术检测了乙酰胆碱，该方法背景干扰小、重现性好、灵敏度高、结果准确、简单快速，符合生物样品分析要求，可用于实际样品定量分析，为基础医学研究及临床诊断提供了有效的检测方法。 ( 参考文献 ) [1] Cai H L， Zhu RH，LiHD， Determination of dansylated monoamine and amino acid neurotransmitters and theirmetabolites in human plasma by liquid1(chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Anal. Biochem.， 2010，396 (1)：103-111. [2] Wang Y， Wang T， Shi X Z， Wan D F， Zhang P P， He X H， Gao P， Yang S L， GuJ R. Analysis of acetylcholine，choline and butyrobetaine in human liver tissues by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem massspectrometry[J]. J. Pharm. Biomed. Anal.，2008， 47(5)：870-875. [3]华莲.液相色谱-质谱联用技术在药物分析中的应用[J].天津药学2009，21(4)： 44-46. [4]罗福文，陶定银，赵鹏，张丽华，贾玉杰，张玉奎.全二维微柱液相色谱-质谱鉴定人胃癌组织中的差异蛋白质[].分析化学，2009，30(10)：1403-1408. PAN Feng·， fMALi，SUN Wei，ZHANG Qing，( Center off1Biomedical Analysis in Ministry of Scientific Research， Third Military Medical University， Chong Qing 400038， China) Abstract： A HPLC-MS method for the determination of acetylcholine in human plasma has been developed. Theseparation was performed on ZORBAX SB-Aq column(4.6mm×150 mm，5 um)with a mobile phase of acetonitrile-0.08% formic acid (5：95) at flow rate 0.5 ml/min. The detection of acetylcholine was carried out under positiveelectrospray ionization and MRM mode. The calibration curves of acetylcholine were linear in the range of 0.5-100.0ng/mL. The RSD was less than 5% and the recovery was in the range of 80%-110%. The results showed the methodwas accurate. Key words： High performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)； Acetylcholine；Plasma 本实验采用液质联用技术检测了乙酰胆碱，该方法背景干扰小、重现性好、灵敏度腐、结果准确、简单快速，符合生物样品分析要求，可用于实际样品定量分析 为基础医学研究及临床诊断提供了有效的检测方法。