枸杞子药材中甜菜碱检测方案(液质联用仪)

智能文字提取功能测试中

分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO (Journal of Instrumental Analysis)第29卷增刊2010年11月Vol. 29Nov. 2010 增刊分析测试学报第29卷 高效液相色谱-串联质谱法快速测定枸杞子中甜菜碱 黄 芳，黄晓兰，吴惠勤，邓 欣，罗辉泰，朱志鑫，林晓珊(中国广州分析测试中心广东省分析测试技术公共实验室，广东 广州 510070) 摘 要： 建立了枸杞子药材中甜菜碱的高效液相色谱-质谱测定方法。优化了样品提取方法、液相色谱条件和质谱参数。样品用60%甲醇超声提取，高效液相色谱分离，色谱柱为正相硅胶柱，流动相为乙腈-水(均含有0.2%的甲酸)(体积比75：25)，流速0.4 mL/min。采用正离子模式的电喷雾质谱检测，多反应选择离子检测(MRM)，检测离子对为： m/z 118→58； m/z 118→59。方法简便快速、准确可靠，已用于实际样品的测定。 关键词：甜菜碱；液相色谱-质谱；枸杞子药材 Determination of Betaine in Lycium Barbamm by HPLC -MS HUANG Fang， HUANG Xiao-lan， WU Hui-qin， DENG Xin， LUO Hui-tai， ZHU Zhi-xin， LIN Xiao-shan (Guangdong Provincial Public Lahoralory of Analysis and Testing Technology， China NationalAnalytical Center(Guangzhou)， Guangzhou 510070， China) Abstract： A method was proposed for the determination of betaine in fruits of Lycium barbarum L.by high-performance liquid chromatograph- mass spectrometry (HPLC -MS). The conditions of ex-traction procedures and parameters of HPLC - MS were optimized. Betaine was extracted with metha-nol-water(60： 40， by volume)， then separated on an Agilent ZORBAX RX -SIL column. Mix-ture of acetonitrile and water(75： 25， by volume) (additional 0.1% formic acid added) was usedas mobile phase， and detected with positive-ion electrospray ionization mass spectrometry (ESI MS)under multiple reaction monitoring(MRM) mode. The results indicated that the method was rapid，selective， sensitive and stable enough to examine betaine in fruits of Lycium barbarum L. Key words： betaine； liquid chromatography- mass spectrum(LC-MS)； Lycium barbamm 枸杞子为茄科植物宁夏枸杞 Lycium barbamm 的干燥成熟果实，是重要的药用植物和药食同源的名贵中药材，具有增强免疫力、降血压、降血脂、抗氧化、抗肿瘤等多方面的药理作用1-2。枸杞子的活性成分主要有3类，甜菜碱为其中之一。2005年版和2010年版《中国药典》对枸杞子中甜菜菜的含量均采用薄层扫描法测定，但该方法操作较繁琐、干扰因素多、误差较大，实际应用中得不到满意结果4。 目前甜菜碱含量的测定方法主要有滴定法、比色法16-81、高效液相色谱法19-14]等。这些方法各有其特点：滴定法成本低，但受样品中色素成分的干扰，测定终点不易判断；比色法需要对甜菜碱初提物进行活性炭脱色、雷氏盐沉淀等多个步骤，处理方法较繁琐，影响测定结果的准确度和重复性。用高效液相色谱法对枸杞子中的甜菜碱进行含量测定，由于甜菜碱结构中无共轭体系，几乎没有紫外吸收，需要在低波长192、195 nm 处才能检测11.141，且灵敏度不理想。本文采用高效液相色谱-串联质谱法对枸杞子中的甜菜碱进行了测定，样品经溶剂超声萃取，稀释后直接测定，无需净化处理，不仅避免了操作步骤太多带来的目标物损失问题，而且分析速度快；采用多反应选择离子检测(MRM)，选择性好，能排除大量干扰；甜菜碱的分离采用正相硅胶柱，克服了在C柱中无保留的缺陷。高效液相色谱-串联质谱法为快速简便地测定枸杞子中甜菜碱含量提供了方法依据。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 Agilent 1200LC/6410B MS 液相色谱/串联四极杆质谱联用仪； AS3120超声波发生器；甲醇、乙腈 为色谱纯试剂，甲酸为分析纯试剂，实验用水为二次蒸馏水。甜菜碱购自中国药品生物制品检定所，枸杞子购自海王星辰药店。 1.2标准溶液配制 准确称取10 mg 甜菜碱标准品，用水溶解并定容至100mL， 得到100 mg/L甜菜碱标准储备液，临用时用水稀释得到系列混合标准溶液。 1.3 样品前处理 取枸杞子药材剪碎，取1g，精密称定，置100 mL 的容量瓶中，加入60%甲醇90mL，超声处理30 min，冷却，用60%甲醇定容，摇匀，过滤，取续滤液1mL至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，用0.45 pm 微孔滤膜过滤后上机测定。 1.4 测定方法 1.4. 1HPLC 条件 Agilent ZORBAX RX-Sil(2. 1 mm×150 mm， 5 um)正相硅胶色谱柱，流动相为乙腈-水(均含有0.2%的甲酸)(体积比75：25)，流速0.4 mL/min， 进样量0.5 pL。 1.4.2 质谱条件 离子源为电喷雾(ESI)离子源，正离子电离模式，干燥气(N，)温度350℃， 雾化气(N，)压力275.8 kPa， 干燥气(N)流速9.0L/min， 电喷雾电压4000V，扫描方式为多反应监测(MRM)模式，质谱分析参数见表1。 表1 甜菜碱的质谱分析参数 Table 1 HPLC-MS/MS paramateres of betaine 组分 保留时间t/min 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能量(V) 源内碎裂电压(V) Betaine 1.93 118 58 25 85 59 25 85 1.4.3 定性定量方法 以其标准溶液峰的保留时间和质谱监测离子丰度比为依据进行定性，以定量离子 m/z 58 的峰面积外标法计算样品中甜菜碱的含量。 2 结果与讨论 2.1 色谱条件的优化 甜菜碱是一类季胺盐化合物，实验分别采用 NH， 色谱柱、Nucleosil SA 阳离子色谱柱、Ultimite Cj色谱柱、Apollo C，色谱柱、Zorbax RX-Sil 色谱柱，以不同的流动相及配比，对甜菜碱标准品检测条件进行优化。结果表明，甜菜碱组分在 NH，色谱柱、Nucleosil SA 阳离子色谱柱、Ultimite Cg色谱柱、Apollo Cg色谱柱中不易保留，几乎同溶剂峰一起流出，影响甜菜碱组分在离子源中的离子化效率，从而影响定量结 果， 而 Zorbax RX-Sil 色谱柱对甜菜碱能有效地保留。 2.2质谱条件的优化 甜菜碱是生物碱化合物，适合用电喷雾离子源，正离子检测方式下，甜菜碱的准分子离子峰[M+H]*为118，二级质谱得到的碎片离子见图1。甜菜碱的母离子为m/z 118，二级碎片离子有 m/z 58 和59， 其质谱碎裂机理推断见图2。优化后标准品和样品中甜菜碱的HPLC-MS/MS图见图3，由图可见样品离子流图中没有干扰峰。另外采用切换法进样，只在甜菜碱出峰时间导入质谱检测，其余均导入废液通道，减少了离子化过程中的基质效应，提高了定量准确性，同时减少了对仪器离子源的污染。 图1 甜菜碱的 ESL/MS质谱图 文献中提取枸杞子中的甜菜碱所用溶剂有80%甲醇、纯甲醇4、纯水151，本方法分别用不同溶剂做 图2甜菜碱的质谱碎裂机理 Fig.2Fragmentation pathways for betaine 了对比实验，得到了较合理的提取方法。实验取样1g共12份，分别对比6种不同的提取方法，测得甜菜碱的含量(见表2)。由表2可见，最佳提取方法为60%甲醇超声30 min， 其中80%甲醇回流提取1h为药典方法。对比可知此法比药典法提取效率高。选用最佳溶剂，考察不同超声提取时间(10、20、30、40 min)的效果，结果显示超声提取30 min 后提取率不再增加，因此选择超声提取30 min。优化提取条件为：60%的甲醇-水为提取剂，超声提取30 min。 图3 甜菜碱标准溶液(A)和样品溶液(B)的 HPLC -MS/MS 总离子流图(TIC)和特征离子流图Fig.3 HPLC-MS/MS chromatogram of betaine standard(A) and sample (B) 2.4 线性范围与检出限 按液相色谱-质谱分析条件对甜菜碱系列标准溶液进行测定，在0.1~5.0 mg/L范围内，方法的线性关系良好，线性回归方程为￥=50 409X+11 855，r值为0.9991，按3倍信噪比计算检出限为1.0 pg/L。 表2不同提取溶剂测得的甜菜碱含量 Table 2 Effect of the extraction solvent 提取溶剂 测得含量(%) 纯甲醇超声30 min 0.88 80% 甲醇超声30 min 0.96 60% 甲醇超声30 min 1.08 40%甲醇超声 30 min 1.05 纯水超声30 min 0.98 80%甲醇回流提取1 h[3] 0.90 表3 HPLC-MS/MS 法定定甜菜碱的回收率(n=5)Table3Recovery and RSD of betaine Added pA/(pg.L) Found pr/(pg·L) Recovery R/% RSD s，/% 0.20 0.21，0.22， 0.19， 0.22， 0.21 105 5.8 0.40 0.42，0.41，0.43，0.41，0.39 103 3.6 0.80 0.81，0.83，0.79，0.78，0.82 101 2.6 表4不同送检样品中甜菜碱测定结果 Table 4 Results of betaine in diffent samples 品名称 甜菜碱含量(%) 枸杞子提取物 9.54 枸杞子药材 1.08 枸杞子药材 0.78 酵母液 9.90 活力碱1 6.24 活力碱2 5.88 2.6 实际样品测定 按照实验方法对不同送检样品中甜菜碱的含量进行检测(见表4)，结果表明该法也适用于其蛇产品中甜菜碱的测定。 ( 参考文献： ) 1白寿宁.宁夏枸杞研究[M].上册.银川：宁夏人民出版社，1998：552-559.234 ( 孙志刚.宁夏枸杞药理研究进展[J].西北药学杂志，2001，3(16)：133-134. ) ( 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].1部.北京：化学工业出版社，2010：232. ) ( 柴发永，李守拙.对《中国药典》枸杞子中甜菜碱含量测定方法的改进[J].中国药品标准，2009，10(2)： 87-90. ) ( [5] 张立木，张颖，牛瑞仙，齐永秀，李同德，郝立勇.非水滴定法测枸杞子中甜菜碱的含量[J].泰山医学院学 报，2005，26(2)： 1 49. ) ( [6] 孙杰，韩丽君，张立新，杨化浩. 比色法测定海藻植物促生长剂中甜菜碱的含量[J].海洋科学，2007，31 (11)：5-8. ) ( 朱桂花，杨高文， 陈 陈光.枸杞半成品成料中甜菜碱含量的测定[J].化学研究与应用，1998，10(4)： 433-435. ) ( 胡彩虹，夏枚生.比 色 法测定甜菜碱和甜菜碱预混剂中甜菜碱的含量[J].含料工业，2001，22(3)：24-25. ) ( 陈少良，毕望富，李金克，王沙生. 反相HPLC 离子对色谱法测定植物组织中的甜菜碱[J].植物学报，2000， 42(10)： 1 014-1018. ) ( [10] 王俊华，曾幼玲，杨洁，张富春. R P-HPLC 法测定长期盐胁迫下盐爪爪和盐穗木中的甜菜碱[J].西北植物学 报，2007，27(3)： 5 15-520. ) ( [11] 甄录旭，方宗华，吴海林，许乐 ， 江中赞. HP L C 法测定枸杞子中甜菜碱的含量[J].安徽 医 学，2007，11(8)： 703-704. ) ( [12] 廖国玲，杨文，张自萍. R P -HPLC 法测定不同产地宁夏枸杞甜菜碱含量[J].宁夏 医 学杂志，2007，29(6)； 492-493. ) ( [13] 廖国玲，张自萍，郭荣. 宁夏枸杞甜菜碱提取物高效液相色谱指纹图谱研究[J].分析科学学报，2007，23(6)： 642-646. ) ( [14] 王晓菁，吴燕，王黎明.固相萃取-高效液相色谱法测定枸杞中甜菜碱[J].食品科学，2010，31(8). 199-201. ) ( [15 ] 张自萍，郭荣，廖国玲，马佳卉.枸杞甜菜碱含量测定方法的比较研究[J].西北农业学报，2007，16(6)： 292-295. ) 第作者：黄 芳()，女，湖南岳阳人，高级工程师， Tel： E-mail： thymol com· 枸杞子药材中甜菜碱的高效液相色谱－质谱测定方法。 优化了样品提取方法、 液相色谱条件和质谱参数。 样品用 60% 甲醇超声提取， 高效液相色谱分离， 色谱柱为正相硅胶柱 ， 流动相为乙腈－水（均含有0.2% 的甲酸）（体积比 75 : 25）， 流速 0.4 mL/min 。采用正离子模式的电喷雾质谱检测，多反应选择离子检测（MRM）。方法简便快速、 准确可靠， 已用于实际样品的测定。