人血浆中草酸检测方案(液相色谱仪)

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SSL-CA20-185Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-482 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.，LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 CL 测定人血浆中草酸含量 LCMSMS-482 摘要：本文使用岛津临床质谱用 LCMS-8050 CL 联用建立了人体血浆中草酸含量测定的方法。考察了方法的线性、准确度、精密度、回收率；结果显示该方法线性范围宽，标准曲线相关系数均大于0.994，方法准确度及精密度均可满足临床日常检验需求。该方法操作简捷、特异性好、灵敏度高、分析速度快，可以为考察人血浆草酸含量与肾脏疾病相关性的临床研究提供参考。 关键词：LCMS-8050 CL 草酸 血浆 草酸是自然界中最简单的二羧酸，外源性草酸主要来源于绿叶植物如菠菜、芹菜、茶叶等，主要以草酸钙的形式存在于肠道，人体吸收很少；内源性草酸主要来源于维生素C和乙醛酸代谢，由于人体不能进一步代谢草酸，如浓度过高，其不能有效从尿液排出，就会导致其在包括肾组织在内的软组织中沉积，从而引发如间质性肾炎、肾结石、肾钙化、关节炎、软骨钙化等各器官验证、纤维化和功能障碍等各种疾病。 血中草酸浓度的测定方法主要有酶分析法、毛细管电泳法、液相色谱法、同位素稀释法等，其中液相色谱法多有报道。草酸极性大、在普通反向柱上无保留；采用 HILIC 模式分析时峰型不佳、血浆基质中杂 质峰干扰、分离度差等问题，亦难以准确定量。另外，草酸在人血浆中含量较低，仅为尿中浓度的1%，而此次检测的目标基质为肾脏肿瘤患者、肾移植患者血浆(经过血透析)，其血浆尿酸含量可能会更低；因此，需建立一种更加灵敏、稳定、准确的草酸含量测定方法。 本实验参考文献报道方法，盐酸酸化血浆后，利用草酸与邻苯二胺反应生成2，3-二羟基喹喔啉，再使用LCMS-8050 CL进行检测；结果表明LC-MS/MS 法的专属性好、灵敏度高、重复性好、分析时间短，在7min 内即可对血浆中低浓度的草酸含量进行测定，可供合作方临床研究参考。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津临床质谱LCMS-8050 CL(国械注进20182400195)。具体配置为 LC-30AD CL×2(输液泵)，DGU-20A5R CL(在线脱气机)，SIL-30ACMP CL (自动进样器))， CTO-30A CL (柱温箱)，CBM-20A CL 系统控制器， LCMS-8050 CL 三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.95 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：InertSustain-C18 HP 100 mm×3.0 mml.D.， 3 um. (P/N：227-31012-05；岛津(上海)实验器材有限公司) 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液；B相-甲醇 流速： 0.4mL/min 柱温：40℃ 进样量：1uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 泵 B.Conc 5 3.00 柱温箱 CTO.RVR 1 3.50 泵 B.Conc 95 4.50 柱温箱 CTO.RVR 0 5.00 泵 B.Conc 95 5.01 泵 B.Conc 5 7.00 控制器 Stop *CTO.RVR 为柱后切换阀， Value值“0”表示流路连接废液；；“1”表示进入质谱。梯度程序中需使用柱后切换阀，使过量衍生试剂邻苯二胺(此梯度条件下邻苯二胺 RT=1.5min±0.2min) 不进入质谱。 质谱条件： 分析仪器：LCMS-8050 CL DL温度：260℃ 离子子： ESI(+) 加热模块温度：450℃ 雾化气流速： 3.0 L/min 干燥气流速： 10.0L/min 加热气流速：10.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 接口温度：380℃ MRM参数：见表2 表2 MRM 参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE(V) Q1 Pre Bias (V) 2，3-二羟基喹喔啉 163.05* 90.05 -10 -28 -19 163.05 117.05 -11 -24 -14 *检测通道为草酸与邻苯二胺衍生产物-2，3-二羟基喔啉；定量离子对为163.05>90.05。 1.3标准品及样品制备 标准溶液配制：精密称取草酸，用0.1%盐酸水溶液配制成系列浓度的工作液备用。具体浓度见表3。 表3工作液浓度信息 (ng/mL) 编号 名称 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 1 草酸 50 200 400 1000 2000 4000 10000 标准曲线样品前处理方法：法95uL纯水，加入5 uL草酸工作液、10 uL浓盐酸；加入100uL纯水泪匀，12000 rpm离心5 min， 取100 pL上清液加入100 pL 邻苯二胺水溶液 (1g/mL)，混匀后于125℃衍生90min；取出后室温冷却后加入500 uL甲醇沉淀， 涡旋 60s后， 12000 rpm 离心10 min， 取300 uL上清液，进样1uL。 质控样品：制备方法与标准曲线样品相同，配制浓度为5、20、200、1000 ng/mL。 血浆样品前处理方法：取100uL血浆样本，加入10 uL浓盐酸混匀后，其余处理步骤同标准曲线样品。 血浆加标回收样品：取95uL血浆基质(为3组草酸本底值最低的血浆混合基质)，加入5uL草酸工作液， 配制成草酸浓度为40、200、1000ng/mL、加入10 uL浓盐酸混匀，其余处理步骤同标准曲线样品。 工作液样品：95uL纯水，加入5 uL草酸工作液、配制成草酸浓度为40、200、1000 ng/mL， 加入 10 uL浓盐酸混匀，其余处理步骤同标准曲线样品。 结果讨论 2.1 MRM 色谱图 图11标准曲线L1浓度点色谱图(浓度5ng/mL) 2.2线性测定结果 对标准品按1.2中的分析条件进行分析，外标法制作标准曲线。标准曲线结果见表4，草酸衍生产物-2，3-二羟基喹喔啉在标准曲线浓度范围内线性相关系数均大于0.999， 准确度满足100±15%以内的要求。 表4 标准曲线结果 编号 名称 线性方程 线性范围(ng/mL) 相关系数 准确度(%) 1 2，3-二羟基喹喔啉 Y=5257.96X-3860.61 5~1000 0.9998 93.6~103.1 2.3准确度及精密度测定结果 取质控样品，重复进样6次，测定，记录峰面积，计算目标目RSD 及准确度。结果见表5。 表5精密度考察结果(n=6) 待测物质 样品浓度 (ng/mL) 精密度 RSD% 准确度 Accuracy% 草酸 5 2.06 98.2 20 1.65 97.2 200 0.65 101.9 1000 1.57 98.3 结果各浓度 RSD 在 0.65~2.06%之间，准确度在97.2~101.9%之间。 2.4血浆基质加标回收率样品测定结果 按1.3项下样品处理和测定方法，考察3个浓度血浆基质加标回收率，结果见表6。 表6加标回收率考察结果(n=3) 待测物质/ 血浆草酸均值 加标后理论值 加标后实际测定均值 RSD% 回收率% 加标样品浓度 (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) 40 145.3 137.9 9.58 94.9 草酸 200 105.3 305.3 322.1 7.37 105.5 1000 1105.3 1064.8 2.11 96.3 结果各浓度加标样品样收率在94.9~105.5%之间， RSD 小于 10%。草酸为内源性物质，加标回收率结果表明在线性范围内，血浆基质无明显基质效应，在未获得草酸空白血浆基质的前提下，采用工作液标准曲线计算血浆样品中的草酸，其准确度符合要求。 图2力加标回收样品色谱图 (137.9ng/mL) 图3 临床血浆样品色谱图 (281.1ng/mL) 结论 使用岛津临床用超高效液相色谱仪 LC-30A CL 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL联用建立了人体血浆中草酸含量的测定方法。血浆经盐酸酸化，可以抑制血浆基质中维生素C向草酸转化；利用草酸与邻苯二胺反应生成2，3-二羟基喹喔啉，其在普通C 18色谱柱上即可很好的保留，且峰型良好；使用 LCMS-8050 CL 进行检测，又具有远高于常规方法的灵敏度。鉴于 LC-MS/MS 法的专属性好、灵敏度高、重复性好、分析时间短，在7min 内即可对血浆中低浓度的草酸含量进行测定，因此可供合作方临床研究参考。 岛津应用云 草酸是自然界中最简单的二羧酸，外源性草酸主要来源于绿叶植物如菠菜、芹菜、茶叶等，主要以草酸钙的形式存在于肠道，人体吸收很少；内源性草酸主要来源于维生素C和乙醛酸代谢，由于人体不能进一步代谢草酸，如浓度过高，其不能有效从尿液排出，就会导致其在包括肾组织在内的软组织中沉积，从而引发如间质性肾炎、肾结石、肾钙化、关节炎、软骨钙化等各器官验证、纤维化和功能障碍等各种疾病。血中草酸浓度的测定方法主要有酶分析法、毛细管电泳法、液相色谱法、同位素稀释法等，其中液相色谱法多有报道。草酸极性大、在普通反向柱上无保留；采用HILIC模式分析时峰型不佳、血浆基质中杂质峰干扰、分离度差等问题，亦难以准确定量。另外，草酸在人血浆中含量较低，仅为尿中浓度的1 %，而此次检测的目标基质为肾脏肿瘤患者、肾移植患者血浆（经过血透析），其血浆尿酸含量可能会更低；因此，需建立一种更加灵敏、稳定、准确的草酸含量测定方法。本实验参考文献报道方法，盐酸酸化血浆后，利用草酸与邻苯二胺反应生成2,3-二羟基喹喔啉，再使用LCMS-8050 CL进行检测；结果表明LC-MS/MS法的专属性好、灵敏度高、重复性好、分析时间短，在7 min内即可对血浆中低浓度的草酸含量进行测定，可供合作方临床研究参考。