动物毛发中赛庚啶检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA20-383Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-516 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. - Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045分析动物毛发中赛庚啶 LCMSMS-516 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪 LCMS-8045，建立了动物毛发中赛庚啶的测定方法。毛发样品经β-葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，酸性乙腈提取， SHIMSEN Styra MCX 固相萃取柱净化浓缩，液相色谱-串联质谱测定，以二苯拉林为内标，定量测定。结果显示该示法线性良好，标准曲线相关系数0.999，1.25 ug/kg加标回收率为105.7%。该方法可用于毛发样品中赛庚啶的定量。 关键词： LCMS-8045兽药残留 毛发a-受体激动剂赛庚啶 赛庚啶是一种H1受体拮抗剂，临床上用于荨麻疹、湿疹、过敏性和接触性皮炎，同时，赛庚啶具有抗5-羟色胺的作用，，可抑制下丘脑饱觉中枢而刺激食欲增加体重，用于畜禽养殖可以促进生长。早在2010年，农业部1519号公告已明确把可乐定、赛庚啶等列入了农业部《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》清单。 农业农村部197-8-2019号公告《动物毛发中赛庚啶残留量的测定液相色谱-串联质谱法》，规定了赛庚啶的含量测定方法。本文参考197-8-2019公告，使用 LCMS-8045 的建立了毛发中赛庚啶的测定方法。该方法灵敏度高、稳定，适用于养殖过程监管。 实验部分 1.1仪器 岛津超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用系统 LCMS-8045。具体配置为 输液泵：LC-20ADXR×2 柱温箱：CTO-20AC 系统控制器：CBM-20A自动进样器：SIL-30ACMP三重四极杆质谱仪：LCMS-8045色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.97 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shim-pack GIST (100 mm×2.1 mm l.D.， 2.0 um) 岛津(上海)实验器材有限公司 P/N： 227-30001-04 流动林：流动相A-0.1%甲酸水溶液流动相B-甲醇 流速： 0.3 mL/min 柱温：40℃ 进样量：5uL 洗针模式：甲醇/水=1：1 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为30%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 4.00 Pumps Pump B Conc. 95 5.50 Pumps Pump B Conc. 95 5.60 Pumps Pump B Conc. 10 8.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8045 加热模块温度：300℃ 离子源： ESI*(1.5kV) DL 温度：150℃ 雾化气流速：3.0 L/min加热气流速：10.0L/min 离孖源温度：400℃ 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气流速：10.0L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM参数 序号 化合物名称 英文名 前体离子 产物离子 CE 288.20 191.00 -30 1 赛庚啶 Cyproheptadine 288.20 96.10* -28 288.20 215.00 -51 2 二苯拉林(内标) Apraclonidine 282.20 116.10 -32 282.20 167.00* -25 *定量离子对 1.3标准品及试剂 标准品：盐酸赛庚啶 (Cyproheptadine hydrochloride，C21H21N·HCI， CAS 号：969-33-5)含量≥98.0%，购自中检院。盐酸二苯拉林((Diphenylpyraline，C，H13NO·HCI， CAS号：61-76-7)含量≥98%，购自TRC公司。 试剂： SHIMSEN Styra MCX(岛津(上海)实验器材有限公司 PN： 380-00853-01)固相萃取柱，室温保存。 甲醇：色谱级，室温保存。 超纯屯：蒸馏水由 Milli-Q Plus 水净化系统经去离子与二次净化制得。 甲酸：色谱级，纯度98%，室温保存。 0.2M乙酸铵缓冲溶液：取15.4g乙酸铵， 至1000 mL水中，乙酸调节pH 至5.2 β-葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶 ： sigma 1.4样品及标准曲线配制 1.4.1样品制备 取毛发0.2g (准确至±0.1mg)， 于50mL离心管中，加25uL二苯拉林内标工作液，混匀。再加入0.2M乙酸铵缓冲溶液 5 mL，加入40pLβ-葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶，混匀，37℃恒温孵育16h， 备用。 在酶解液中加入500 uL 5M 盐酸溶液，终止酶解。再加入5 mL乙腈/0.1M 盐酸水(9：1，v/v)提取液，混匀，离心。取上清液，用SHIMSEN Styra MCX(岛津(上海)实验器材有限公司，PN：380-00853-01)固相萃取柱净化浓缩。具体为： SHIMSEN Styra MCX 依次用甲醇、水各3mL活化。取全部备用液过柱，用水3mL、甲醇3mL分别淋洗，抽干，5%氨水甲醇溶液5 mL洗脱，收集洗脱液，50℃氮吹至干，500 uL流动相初始溶液复溶，过 0.22 um 尼龙滤膜，上机。 1.4.2标准曲线配制 1.4.2.1标准储备液(1mg/mL) 取盐酸赛庚啶、盐酸二苯拉林标准品各约 10 mg， 精密称定，分别于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度分别为 1 mg/mL的盐酸赛庚啶和盐酸二苯拉林标准贮备液。4℃下保存，有效期6个月。1.4.2.2标准工作液(10ug/mL) 精密量取盐酸赛庚啶标准贮备液各 10 uL，于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为100ng/mL的盐酸赛庚啶标准工作液。4℃下保存，有效期1个月。 1.4.2.3内标工作液 精密量取盐酸二苯拉林储备液 10 uL， 于100 mL量瓶中，用甲希稀释至刻度，配制成含盐酸二苯拉林100ng/mL内标中间液。于4℃下保存，有效期1个月。 1.4.2.4标准曲线制备 精密量取标准工作液和内标工作液工量，用乙腈-0.1%甲酸溶液稀释成赛庚啶浓度为0.1、0.2、0.5、1、5和 10 ng/mL系列标准工作液，其中含盐酸二苯拉林的浓度的浓度均为 5ng/mL， 临用现配。 结果讨论 2.1标品质谱图与色谱图 将100 ng/mL赛庚啶和二苯拉液溶液进样分析，采用产物离子扫描模式确认碎片离子，如下图1所示，产物离子清晰可辨。对0.1ng/mL标准溶液分析， MRM 色谱图如图2所示，赛庚啶响应良好， S/N=40.25，无通道干扰。 图1赛庚啶和二苯拉林 MS'质谱图 图2(0.5 ng/mL 赛庚啶和二苯拉林混标色谱图 2.2性性关系及检出限、定量限 对系列标准曲线溶液进行分析，以面积比为纵坐标，浓度比为横坐标，进行线性拟合。结果如表3和图3所示，赛庚啶在0.1-10 ng/mL范围内，线性良好，线性相关系数0.999。以0.1 ng/mL数据为依据，根据信噪比S/N=3、S/N=10计算检出限(LOD)、定量限(LOQ)，检出限和定量限均低于 0.25 ug/kg， 满足测定需求。 图3标准曲线 表3 标准曲线、检出限及定量限 中文名称 线性方程 相关系数r 准确度 (%) 检出限(ug/kg) 定量限(ug/kg) 赛庚啶 Y=(0.2358873)X+(-0.00085811119) 0.999 91.4-108.2 0.025 0.075 2.3重复性考察 对 0.5 ng/mL的标准溶液连续分析6次，计算保留时间和峰面积的RSD。结果见表4，保留时间RSD=0.14%，峰面积的 RSD=1.92%。仪器稳定性良好。 表4保留时间和面积RSD 中文名称 保留时间 RSD(%) 面积RSD (%) 赛庚啶 0.14 1.92 2.4加标回收率考察 在空白毛发样品上进行1.25 ug/kg 的加标回收试验，平行3份。赛庚啶回收率105.7%之间， RSD=3.43%。满足测定需要。 表5饲料加标回收率结果 样品名称 加标浓度(1.25 ug/kg) 加标回收率/% 平均值% RSD/% 加标1 103.3 加标2 103.6 105.7 3.43 加标3 109.7 结论 本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪 LCMS-8045，建立了毛发中赛庚啶测定方法。方法检出限0.025 ug/kg， 定量限0.075 ug/kg， 在0.1-10 ng/mL范围内，线性相关系数0.999。该方法灵敏度高，线性良好，加标回收率高，定量准确。该方法可供农口相关行业参考。 岛津应用云 本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪LCMS-8045，建立了动物毛发中赛庚啶的测定方法。毛发样品经β-葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，酸性乙腈提取，SHIMSEN   Styra MCX固相萃取柱净化浓缩，液相色谱-串联质谱测定，以二苯拉林为内标，定量测定。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数0.999，1.25   μg/kg加标回收率为105.7%。该方法可用于毛发样品中赛庚啶的定量。